雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色在淋巴結(jié)檢出數(shù)量不足CRC標(biāo)本脈管侵犯評估中的應(yīng)用價值

凌志鋒

廣東省平遠(yuǎn)縣人民醫(yī)院病理科 514600

近年來，生活方式的改變導(dǎo)致國內(nèi)外結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)病率逐漸提升，而結(jié)直腸癌切除手術(shù)開展數(shù)量逐漸增多[1]。在手術(shù)中或手術(shù)后，病理科往往需要對標(biāo)本展開病理檢驗，了解腫瘤病理分期情況，以此對患者病情進(jìn)行準(zhǔn)確評估[2-3]。為對患者疾病做出臨床分期判斷，對預(yù)后進(jìn)行盡早評價，在獲取CRC標(biāo)本后，常規(guī)檢查中，至少需要檢出12枚淋巴結(jié)，才能對臨床分期做出判斷。然而，部分患者因年齡、化療或腫瘤發(fā)生部位的影響，無法檢出12枚淋巴結(jié)，此時對其進(jìn)行分期存在一定困難[4]。脈管侵犯為惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的必要條件，因此采用有效方法判斷有無脈管侵犯，對疾病判斷有重要價值[5]。本文選取此類標(biāo)本，以對照分析方式，探索雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色在脈管侵犯評估中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2011年3月—2013年12月手術(shù)切除且確診的CRC患者標(biāo)本，共116份，經(jīng)檢測淋巴結(jié)檢出數(shù)量不足12枚，患者未合并其他惡性腫瘤，臨床資料完整，可隨訪，年齡29～64歲，平均年齡(59.46±2.31)歲。

1.2 方法 將本組標(biāo)本均一分為二，一份行常規(guī)HE染色，一份行雙重免疫組化染色。雙重免疫組化染色：對石蠟切片進(jìn)行脫蠟并水化處理，用EDTA抗原對其行20min的熱修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，10min左右。根據(jù)工作濃度，將兔抗CK、鼠抗D2-40及CD34混合，制為雞尾酒抗體，也即即用型混合一抗，在37℃的盒子中，行60min孵育。用鼠抗—堿性磷酸酶、兔抗—過氧化物酶，根據(jù)一定比例進(jìn)行混合，在室溫中行20min孵育。用DAB試劑行15min顯色處理，滴加AP-red試劑，行15min顯色，用蘇木精對其復(fù)染，以流水行15min沖洗，用75%乙醇對濕片組織烤干，用時10s，讓其冷卻到室溫狀態(tài)，以中性樹膠對玻片進(jìn)行加蓋，封固。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) (1)D2-40/CD34檢測顯示胞漿及包膜著色為紅色，判定是脈管；CK為胞漿著色為棕黃色，其中陽性區(qū)域含腫瘤細(xì)胞、癌旁正常上皮組織，來對脈管中癌栓加以判斷。脈管侵犯：按照Delphi法來進(jìn)行判斷[6]，具體為：脈管圍繞腫瘤細(xì)胞巢50%以上，即可判定為脈管侵犯。(2)對確定脈管侵犯的標(biāo)本，進(jìn)一步觀察發(fā)生部位、癌細(xì)胞數(shù)量及侵犯程度，并對這些因素和患者生存期之間的關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 脈管侵犯評估效果 116份標(biāo)本，經(jīng)HE染色，顯示脈管侵犯陽性24例，檢出率20.69%；雙重免疫組化染色顯示脈管侵犯陽性48例，檢出率41.38%；兩種方法對脈管侵犯的檢出率比較差異顯著(χ2=11.600，P=0.001)。在HE染色判定為陽性的標(biāo)本中，有3份標(biāo)本經(jīng)雙重免疫組化染色判斷為假陽性，實際是回縮裂隙。

2.2 雙重免疫組化染色的進(jìn)一步分析結(jié)果 經(jīng)雙重免疫組化染色判定為陽性的48份標(biāo)本中，脈管侵犯的發(fā)生部位：壁內(nèi)侵犯23份(47.92%)、壁外侵犯19份(39.58%)、壁內(nèi)外侵犯6份(12.50%)，脈管侵犯程度：局部侵犯20份(41.67%)、中度侵犯19份(39.58%)、廣泛侵犯9份(18.75%)；癌栓細(xì)胞數(shù)≥5.5 22份(45.83%)、<5.5 26份(54.17%)?？梢娒}管侵犯多數(shù)為壁內(nèi)侵犯，以局部侵犯最為常見，癌栓細(xì)胞數(shù)<5.5的占比較高。

2.3 預(yù)后情況分析 經(jīng)隨訪，雙重免疫組化染色判定為陽性的48份標(biāo)本中，患者平均生存時間為(52.36±4.18)個月；其余68份為陰性的標(biāo)本中，患者平均生存時間為(82.77±6.94)個月；經(jīng)對比，雙重免疫組化染色判定為陽性的患者生存時間明顯短于染色結(jié)果為陰性的患者(t=27.070，P=0.000)。

3 討論

對于CRC患者而言，對其進(jìn)行TNM分期判定是評估病情、分析預(yù)后的重要措施。要想進(jìn)行臨床分期判斷，就必須對手術(shù)切除的標(biāo)本進(jìn)行病理檢查，分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，然而，部分標(biāo)本檢出的淋巴結(jié)數(shù)量較少，可能會導(dǎo)致N分期、淋巴結(jié)狀態(tài)低診斷，這就導(dǎo)致淋巴結(jié)檢出結(jié)果無法為術(shù)中及術(shù)后的病理判斷提供依據(jù)[7-8]。另外，即使淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢查結(jié)果為陽性，也可能由于淋巴結(jié)檢查數(shù)量較少，導(dǎo)致分期判斷偏低，或患者無進(jìn)展生存期評估有偏倚。對于這部分患者，就需要另外尋找方法，判斷患者病情，以便評估預(yù)后，提前為患者制定下一步的治療計劃[9]。

惡性腫瘤患者中，脈管侵犯是和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移獨立的危險因素，運用脈管侵犯評估也能在一定程度上掌握患者病情，解決淋巴結(jié)檢出數(shù)量不足這一問題。在脈管侵犯情況的常規(guī)評估中，檢驗醫(yī)師通常是借助HE染色，在光鏡下查看，然而這一操作相對復(fù)雜，且不同病理醫(yī)師獲得的結(jié)論可能有所不同，易出現(xiàn)分歧，這是近年來臨床亟須解決的問題。

免疫組化染色是病理檢測的常用方法之一，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。本文中嘗試運用雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色法評估標(biāo)本的脈管侵犯情況，該方法能準(zhǔn)確區(qū)分脈管、裂隙，便于醫(yī)師識別脈管中的癌栓，同時也可將一些微小癌栓檢查出來[10]。在這一結(jié)果上獲取的半定量數(shù)據(jù)，能夠?qū)γ}管侵犯和預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行預(yù)測。因此，這一方法可以用作CRC患者淋巴結(jié)檢出量不足時的補充診斷方法。本文中對116份標(biāo)本實施HE染色和雙重免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙重免疫組化染色對脈管侵犯的檢出率明顯高于HE染色的檢出率(P<0.05)，說明雙重免疫組化染色在判斷脈管侵犯中的效果更為明顯。另外，雙重免疫組化染色還能對侵犯情況進(jìn)行進(jìn)一步分析，如本組經(jīng)雙重免疫組化染色判定為陽性的48份標(biāo)本中，脈管侵犯多數(shù)為壁內(nèi)侵犯，以局部侵犯最為常見，癌栓細(xì)胞數(shù)<5.5的占比較高。對患者預(yù)后進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，雙重免疫組化染色判定為陽性的患者生存時間明顯短于染色結(jié)果為陰性的患者(P<0.05)，可見雙重免疫組化染色結(jié)果能夠反映CRC患者預(yù)后情況。

通過總結(jié)臨床經(jīng)驗，筆者發(fā)現(xiàn)雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色法具有如下優(yōu)勢：(1)和HE染色相比，該方法能在同一平面上對脈管和可疑癌栓組織間的關(guān)聯(lián)予以呈現(xiàn)；同時，應(yīng)用雞尾酒抗體夠節(jié)約檢測時間，降低檢測人員的工作量，成本較低，便于推廣。(2)若CRC患者病變相對局限，應(yīng)用雞尾酒抗體進(jìn)行檢測，可節(jié)約標(biāo)本，防止重復(fù)切片造成標(biāo)本不足等問題出現(xiàn)。當(dāng)然，該檢測方法也存在一定不足，首先將D2-40、CD34聯(lián)合應(yīng)用時，在區(qū)分血管、淋巴管的過程中存在一定局限，醫(yī)師對血道轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移難以做出預(yù)測。另外，若脈管中癌細(xì)胞數(shù)量較少，應(yīng)用這一方法進(jìn)行分析，醫(yī)師的判斷仍具備一定主觀性。總體來看，雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色優(yōu)勢更突出。

綜上所述，在淋巴結(jié)檢出數(shù)量不足結(jié)直腸癌(CRC)標(biāo)本脈管侵犯評估中，雞尾酒抗體D2-40/CD34-CK雙重免疫組化染色能夠?qū)γ}管侵犯情況進(jìn)行分析，同時可反映侵犯程度，對患者預(yù)后進(jìn)行評估，值得推廣。