高效液相色譜法結(jié)合固相萃取技術(shù)同時檢測飼料中氨苯砜和咖啡因的方法研究

陸 梅， 趙雪寧， 李 宏， 賀習(xí)文 ， 李 俊

（1.陜西省農(nóng)業(yè)檢驗檢測中心，陜西西安 710000；2.陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測股份有限公司，陜西渭南 714000；3.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，陜西西安 710016；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

氨苯砜是類抑菌劑， 對麻風(fēng)桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，其作用機(jī)理與磺胺類藥物相似，能干擾細(xì)菌二氫葉酸合成酶的合成（彭濤等，2015；王海波等，2015）?？Х纫蚴屈S嘌呤生物堿，主要用作中樞神經(jīng)的興奮劑，具有抗疲勞、興奮神經(jīng)的作用（鄭容等，2020；王文權(quán)等，2020）。 這兩種藥物藥量過大都會損害肝、腎，誘發(fā)呼吸道疾病。除此之外，咖啡因還有成癮性，一旦停用會出現(xiàn)精神萎靡、渾身疲軟等不適癥狀。 我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部235 號公告（2021）明確規(guī)定氨苯砜為禁用藥物，動物源性食品中不得檢出， 咖啡因只允許在本身含有咖啡因的咖啡、茶及其飲料制品中存在，在飼料產(chǎn)品中禁止添加。 飼料中違規(guī)添加這兩種藥物會導(dǎo)致動物體內(nèi)殘留，影響到健康。我國目前沒有同時檢測飼料中氨苯砜和咖啡因的國家標(biāo)準(zhǔn)， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第358 號-1-2020（2021）只有飼料中氨苯砜殘留量的LC-MS/MS 檢測方法， 其檢測過程復(fù)雜，速度較慢， 成本較高。 其他文獻(xiàn)資料中也有氨苯砜和咖啡因的方法，主要有高效液相色譜法、LCMS/MS 法、酶聯(lián)免疫法等。 何丹和楊林（2013）利用RP-HPLC 法測定氨苯砜藥片的含量， 劉高峰等（2010）利用RP-HPLC 法同時測定家兔體內(nèi)氨苯砜、咖啡因和美托洛爾的含量，高慧等（2020）利用HPLC 法測定氨苯砜等7 種添加劑， 另有李彬（2020）、范敏敏等（2019）測定咖啡因和氨苯砜的相關(guān)報道。 陳秀芬等（2021）、劉紅等（2019）、謝潔等（2015）以及田云等（2009）則利用LC-MS/MS法分別測定奶粉等不同基質(zhì)中咖啡因和氨苯砜的方法，另有鄭小嬌等（2015）、陶光燦等（2013）有關(guān)氨苯砜和咖啡因酶聯(lián)免疫法的報道。 這些方法大多適用于血液制品、動物組織和奶粉等樣品檢測，不適用基質(zhì)較為復(fù)雜的飼料樣品。 本研究使用HPLC 法，通過優(yōu)化色譜條件和樣品處理方法，結(jié)合固相萃取技術(shù)， 建立了一種能同時測定飼料中氨苯砜和咖啡因的定量分析方法，成本低廉、前處理簡單、定量準(zhǔn)確，能為飼料產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器、 試劑及材料 Ultimate 3000 高效液相色譜儀 （Thermo Fisher Scientific 公司， 美國）；H1850 型離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；MS205DU 型十萬分之一天平（Mettler Toledo公司）；CP224C 型萬分之一天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；MX-S 型渦旋混合儀（大龍興創(chuàng)儀器（北京）股份有限公司）；KQ-100DB 型數(shù)控超聲波提取儀 （昆山市超聲儀器有限公司）；MTN-4800A 型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

氨苯砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) （中國食品藥品檢定研究院，純度99.2%）；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（壇墨質(zhì)檢，純度98.0%）；乙腈（色譜純，美國Sigma 公司）；甲醇（色譜純，美國Sigma 公司）；冰乙酸（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；1%乙酸乙腈溶液： 吸取冰乙酸10 mL 于1000 mL 容量瓶中， 用乙腈定容至刻度，搖勻。

C18固相萃取柱，100 mg/3 mL（月旭科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：1%乙酸溶液+乙腈=75+25；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2 樣品處理過程 提?。簻?zhǔn)確稱取2 g 試樣，置于50 mL 具塞離心管中，加入5 mL 含1%乙酸的乙腈溶液，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，8000 r/min 離心5 min，準(zhǔn)確移取上清液于另一離心管中， 殘渣用5 mL 1%乙酸乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，在50 ℃下氮?dú)獯抵两桑尤? mL 水混勻。

凈化：取C18固相萃取柱，先后用3 mL 甲醇、3 mL 水活化， 將上述樣液全部轉(zhuǎn)入C18固相萃取柱中，控制流速不超過1 mL/min，待樣液全部通過萃取小柱后，用3 mL 水淋洗，抽干30 s，用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，在50 ℃下氮?dú)獯蹈?，? mL 初始流動相復(fù)溶，過0.45 μm 濾膜后供高效液相色譜儀測定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制：準(zhǔn)確稱取氨苯砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01136 g、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01150 g， 分別置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度， 配制成濃度分別為氨苯砜1126.9 μg/mL、咖啡因1127.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于-18 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合中間液的配制： 準(zhǔn)確移取氨苯砜標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.89 mL、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.89 mL 于10 mL 棕色容量瓶中， 用甲醇稀釋定容至刻度，配制成濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)混合中間液，于-18 ℃保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇 經(jīng)查兩種化合物在弱酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，實驗考察了0.1%甲酸溶液、0.1%磷酸溶液及1%乙酸溶液三種不同酸性環(huán)境下流動相對目標(biāo)化合物的洗脫效果。 結(jié)果表明，使用0.1%磷酸溶液洗脫時，兩種化合物均出現(xiàn)了不同程度的拖尾，選用0.1%甲酸溶液洗脫時，咖啡因的保留時間過短，色譜峰尖銳，但分離效果不好，而使用1%乙酸溶液洗脫時，效果最佳。 因此本研究在考慮流動相的配比時，水相采用1%乙酸溶液，提供良好的酸性環(huán)境，不但可以很好地洗脫目標(biāo)化合物，還可以更好地保護(hù)色譜柱。

有機(jī)相的選擇上， 采用甲醇作為有機(jī)相時，氨苯砜的洗脫時間較長， 且甲醇在275 nm 處的吸收峰較多，干擾了目標(biāo)峰的分離。 采用乙腈作為有機(jī)相時，氨苯砜的保留時間提前，且比甲醇有更少的吸收峰，綜合考慮，選用乙腈作為有機(jī)相配比。

在洗脫方式上分別對等度及梯度洗脫進(jìn)行了試驗，結(jié)果表明，等度洗脫和梯度洗脫都能夠保證兩種化合物在10 min 內(nèi)洗脫完成，兩種方式對咖啡因的峰型影響不大， 梯度洗脫時氨苯砜的峰型要更尖銳一些，但由于流動相比例的改變，造成基線拉升，影響了氨苯砜峰的分離，綜合考慮，采用等度洗脫的方式進(jìn)行洗脫。

2.1.2 固相萃取柱的選擇 本研究共嘗試了3 種不同填料的固相萃取小柱，分別為強(qiáng)陽離子固相萃取柱（MCX）、親水性固相萃取柱（HLB）和C18 固相萃取柱，3 種產(chǎn)品均來自于月旭科技有限公司，規(guī)格均為100 mg/3 mL，按照廠家提供的使用方法，分別進(jìn)行了回收率測試。 實驗表明，HLB 固相萃取柱對兩種化合物的保留效果最低，多組測試回收率為20% ～40%，MCX 固相萃取柱對氨苯砜的保留效果最好，能夠達(dá)到90%以上，但咖啡因的回收效果不佳， 回收率為70%～75%，C18 固相萃取柱對兩種化合物均有良好的保留效果， 因此選用C18 固相萃取柱對樣品提取液進(jìn)行凈化。兩種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)樣品色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品的色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍 實驗用混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液配制系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液， 以優(yōu)化后的條件進(jìn)行測定，以濃度作為橫坐標(biāo)、目標(biāo)化合物峰面積作為縱坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，兩種目標(biāo)化合物濃度為0.1 ～50 μg/mL 時呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.9999，表1 為兩種目標(biāo)化合物的曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

表1 目標(biāo)化合物的曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.2.2 檢出限和定量限 以信噪比（S/N）的3 倍為檢出限（LOD），信噪比（S/N）的10 倍為定量限（LOQ）， 通過向基質(zhì)空白中進(jìn)行加標(biāo)的方式來計算S/N 的值。結(jié)果表明，當(dāng)兩種目標(biāo)化合物的加標(biāo)量為0.05 mg/kg 時，響應(yīng)值為3 倍的信噪比，加標(biāo)量為0.2 mg/kg 時，響應(yīng)值為10 倍的信噪比。目標(biāo)化合物的檢出限、定量限見表2。

表2 目標(biāo)化合物的檢出限、定量限、回收率和精密度

2.2.3 回收率和精密度考察 使用不含兩種目標(biāo)化合物的某配合飼料分別進(jìn)行3 組不同濃度的添加回收實驗， 其中最低濃度用來驗證檢出限的回收率，中濃度用來驗證定量限的回收率，同時添加一組高濃度用以驗證方法的適用性和穩(wěn)定性。 此外，每個濃度各添加6 份，連續(xù)測定3 d，用測得的實驗結(jié)果來計算日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。 實驗所得回收率和精密度見表2。

從表2 可以看出，3 種目標(biāo)化合物的回收率為89.7% ～107.5%， 日內(nèi)變異系數(shù)為0.88% ～1.35%，日間變異系數(shù)為1.75% ～3.14%，證明本研究回收率和精密度良好。

2.2.4 方法適用性考察 為驗證方法對不同飼料樣品的適用性，實驗挑選了犢牛精料補(bǔ)充料、豬用配合飼料、豬用濃縮飼料、雞用復(fù)合預(yù)混合飼料和豆粕等共5 種不同樣品，每個品種飼料添加6 組，分別進(jìn)行了定量限的加標(biāo)回收實驗， 驗證了方法的穩(wěn)定性。 結(jié)果見表3。

表3 不同品種飼料的適用性測試

從表3 可以看出， 本研究在5 種不同品種飼料中均得到了良好的回收率和精密度， 證明此方法穩(wěn)定性良好， 能夠滿足不同品種飼料中的氨苯砜和咖啡因的檢測。

2.3 實際應(yīng)用 本研究一共測試了25 批次樣品，不同品種飼料各5 批，其中僅1 批豬用配合飼料中檢出咖啡因，含量為0.172 mg/kg，低于本方法定量限，其余樣品中均未檢出兩種目標(biāo)化合物。

3 結(jié)論

本實驗基于HPLC 法及固相萃取技術(shù)，建立了一種同時測定飼料中氨苯砜和咖啡因的定量方法。結(jié)果表明，該方法在不同飼料中均有良好的回收率和穩(wěn)定性，且檢出限和定量限低，方法前處理簡單，成本低廉，檢測效率較高，不僅可以滿足飼料中氨苯砜和咖啡因違法添加篩查檢測，同時為飼料中氨苯砜和咖啡因的檢測提供了方法參考和借鑒。