稻瘟病菌拮抗菌HKD-6的篩選、鑒定及其抑菌物質分析

白 敬，吉馨予，趙國群

（河北科技大學，河北 石家莊 050018）

水稻是世界上重要的糧食作物之一，為全球約半數以上的人口提供主糧［1］。然而水稻生產面臨著諸多病蟲害的威脅，其中由稻瘟病菌引發(fā)的稻瘟病被列為三大病害之首，每年造成水稻產量損失10%～30%，嚴重影響了水稻的產量和品質［2-3］。

目前，我國對稻瘟病的控制主要采用化學防治和抗性品種選育等方法。但化學農藥的長期使用極易引起藥物殘留、環(huán)境污染和病菌耐藥性增強等問題，不利于我國農業(yè)綠色發(fā)展［4］。盡管抗性品種的種植能夠在一定程度上預防稻瘟病的發(fā)生，但現有的抗病品種通常產量較低、品質較差且選育進程較慢，限制了其推廣應用。利用拮抗微生物及其代謝產物對稻瘟病進行控制的生物防治方法，因其具有綠色、安全、可持續(xù)等優(yōu)點，現已逐漸成為研究熱點［5-6］。

芽孢桿菌(Bacillus)作為一類重要的生防資源，已被廣泛用于多種植物病害的生物防治。該類菌除了具有良好的環(huán)境相容性、促進農作物生長和誘導抗病性等優(yōu)點外，還能夠產生多種脂肽類抗生素、細胞壁降解酶和抑菌蛋白等，干擾和抑制病原菌細胞壁和細胞膜的合成，具有廣譜的抗菌活性［7-8］。目前已發(fā)現多種芽孢桿菌對稻瘟病菌表現出良好的拮抗作用，如解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)［9-11］、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)［12］、貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)［13］、堅強芽孢桿菌(B. firmus)［14］等。沙月霞等［13］從水稻葉片中分離得到1株對稻瘟病菌有抑制作用的植物內生菌貝萊斯芽孢桿菌E69，其對分生孢子萌發(fā)、附著胞形成和菌絲生長的抑制率均達到84%以上。韓雨桐等［12］從水稻根系土壤中篩選獲得的枯草芽孢桿菌Sc2對稻瘟病菌的抑制率達73.44%，且當其與三環(huán)唑以1∶2的比例復配使用時，對稻瘟病的防治效果可達90.33%。谷春艷等［9-11］均證實了解淀粉芽孢桿菌具有抑制稻瘟病菌生長的活性，其發(fā)酵液可破壞稻瘟病菌的細胞膜，造成該病菌的菌絲變形和斷裂。Suryadi等［14］發(fā)現堅強芽孢桿菌能夠有效地抑制稻瘟病菌菌絲的生長，抑制率達73%。因此，利用芽孢桿菌防治稻瘟病菌是一種具有較大應用潛力的生物防治手段，篩選高效的拮抗菌株是對稻瘟病菌進行生物防治的關鍵。

本實驗以稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌株Guy11為靶標，從實驗室已保存的細菌中篩選對其具有良好拮抗作用的菌株。結合形態(tài)學觀察、生理生化性質測定，以及16S rDNA、gyrA與gyrB基因序列分析，對該菌株進行了分類學鑒定，并對其抑菌物質進行了分析，以期為稻瘟病菌生防菌劑的開發(fā)提供新的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

病原菌：稻瘟病菌菌株Guy11，由中國農業(yè)科學院植物保護研究所惠贈。

基本培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、番茄燕麥培養(yǎng)基。

幾丁質酶檢測培養(yǎng)基：膠體幾丁質（1.00%）、K2HPO4（0.03%）、KH2PO4（0.03%）、NaCl（0.40%）、MgSO4·7H2O（0.05%）、酵母浸粉（0.15%）、瓊脂（2.00%）。

β-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基：昆布多糖（1.00%）、K2HPO4（0.065%）、KH2PO4（0.25%）、（NH4）2SO4（0.05%）、NaCl（0.25%）、MgSO4·7H2O（0.012%）、酵母浸粉（0.15%）、瓊脂（2.00%）。

蛋白酶檢測培養(yǎng)基：牛肉膏（0.50%）、蛋白胨（1.00%）、氯化鈉（0.50%）、脫脂奶粉（2.00%）、瓊脂（2.00%）。

1.2 拮抗菌株的篩選

利用平板對峙法篩選對稻瘟病菌具有拮抗作用的菌株。取5 mm稻瘟病菌菌塊，將其接種于新鮮配制的PDA平板中心，在28 ℃下培養(yǎng)3 d。在距離稻瘟病菌2 cm處，利用無菌打孔器對稱打孔，在每個孔中滴加 100 μL待篩選的菌液，在28 ℃下培養(yǎng)7～10 d。以LB空白培養(yǎng)基作為對照；每個處理重復3次。待菌落長滿平板時測量稻瘟病菌的菌落直徑，并根據以下公式計算抑菌率：抑菌率（%）=［（對照組病原菌的菌落直徑-處理組病原菌的菌落直徑）/對照組病原菌的菌落直徑］×100%。

1.3 拮抗菌株的分類學鑒定

1.3.1 形態(tài)學觀察挑取拮抗作用較好的菌株于LB平板上劃線，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察單菌落的形態(tài)、大小、顏色、形狀、褶皺程度等特征，并進行革蘭氏染色實驗。

1.3.2 生理生化性質的測定依據《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對待測菌株進行明膠液化、淀粉水解、厭氧生長、V-P反應、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、硝酸鹽還原和不同碳源（D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇）生長等實驗。各項實驗均重復3次。

1.3.3 分子生物學鑒定基于16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列，對拮抗菌株進行分子生物學鑒定。擴增引物參照李生樟等［15］的方法進行設計，并由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，引物序列見表1。利用NCBI中的Blast模塊分別對16S rDNA、gyrA和gyrB基因擴增序列進行Blast比對分析，并通過Mega X軟件中的Neighbor-Joining（鄰接法）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 對拮抗菌株進行分子生物學鑒定所用的擴增引物

1.4 拮抗菌株的生長特性

1.4.1 生長曲線的測定挑取單克隆菌株于LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下過夜培養(yǎng)。次日以2%的接種量將菌株轉接于100 mL LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下以200 r/min的轉速振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣1次，測定菌液的OD600值。設置3組平行實驗。

1.4.2 菌株耐鹽能力、對pH值耐受性的測定耐鹽能力：將待測菌株的培養(yǎng)液按2%的接種量分別接種至含不同濃度（0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、7.0%、10.0%、15.0%）NaCl的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)液的渾濁情況，并測定樣品的OD600值，判斷菌體的生長情況。設置3組平行實驗。

對pH值的耐受性：將待測菌株的培養(yǎng)液按2%的接種量分別接種至具有不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0）的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)液的渾濁情況，并測定樣品的OD600值，判斷菌體的生長情況。設置3組平行實驗。

1.4.3 菌株與化學殺菌劑的生物相容性測定將40%稻瘟靈和75%三環(huán)唑粉針劑分別配制成一系列濃度的含藥LB平板，其中40%稻瘟靈含量分別為0.01、0.05、0.10、0.50、1.50、2.00 mL/L；75%三環(huán)唑粉針劑含量分別為50、100、200、300、400、500 mg/L。取10 μL拮抗菌的菌懸液，將其均勻涂布于平板表面，以加入等量無菌水為空白對照，在28 ℃恒溫下培養(yǎng)5 d，利用平板稀釋法測定菌體的生長情況并統(tǒng)計數量。每個處理設置 3組平行實驗。

1.5 拮抗菌株抑菌物質的分析

1.5.1 抗生素合成相關基因的PCR檢測參考Joshi等［16-17］的方法，分別合成了表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)、豐原素(Fengycin)、溶桿菌素(Bacylisin)、桿菌霉素(Bacillomycin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)和假定蛋白(YndJ)等合成相關基因的引物，詳見表2。以拮抗菌的基因組DNA為模板進行PCR檢測。PCR反應體系：Taq Mix 10 μL、引物（10 μmol/L）各0.5 μL、模板DNA（60 ng/μL）1 μL，用ddH2O補足至20 μL。PCR的擴增條件按照說明書進行設置，其中基因的退火溫度為52 ℃。

表2 用于檢測拮抗菌株抗生素合成相關基因的引物

1.5.2 細胞壁降解酶編碼基因的PCR檢測基于CAZy和Uniprot數據庫，設計葡聚糖酶和幾丁質酶編碼基因的擴增引物，并參考李界秋等［18］的方法合成枯草桿菌蛋白酶基因(qk)的擴增引物（表3）。PCR反應體系和擴增條件與上述抗生素合成相關基因的檢測條件一致。

表3 用于檢測拮抗菌株中細胞壁降解酶編碼基因的引物

1.5.3 拮抗菌株胞外酶活性的檢測利用蛋白酶、幾丁質酶和葡聚糖酶特異性檢測平板，測定拮抗菌株的胞外酶活性。取10 μL拮抗菌發(fā)酵液，分別接種于上述3種特異性檢測平板上，在28 ℃下培養(yǎng)2 d，然后觀察菌落周圍是否有透明圈產生。對于幾丁質酶和葡聚糖酶檢測平板，先用剛果紅溶液（質量分數為0.1%）覆蓋染色15 min，再用1 mol/L NaCl溶液處理15 min，最后觀察是否有透明圈形成。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

以稻瘟病菌Guy11為靶標，利用平板對峙法從26株細菌菌株中篩選獲得18株具有拮抗性能的菌株，其中抑菌率大于50%的菌株共有4株，以菌株HKD-6的抑菌效果最好（表4）。HKD-6能夠顯著抑制稻瘟病菌菌絲的生長（圖1）。

表4 供試細菌菌株對稻瘟病菌的抑制率

圖1 菌株HKD-6對稻瘟病菌的抑制效果

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征將菌株HKD-6劃線于LB固體培養(yǎng)基表面，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌落呈現淺黃色且不透明形態(tài)，表面干燥，有褶皺分布，菌落邊緣不規(guī)則（圖2A）。通過革蘭氏染色實驗，菌株呈陽性（圖2B）。

圖2 菌株HKD-6的形態(tài)學特征

2.2.2 生理生化特征生理生化實驗結果（表5）表明：菌株HKD-6可以在厭氧條件下生長；能夠利用D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇作為碳源；能夠水解明膠和淀粉；其檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原反應和V-P反應均呈陽性，但不能利用丙酸鹽。據此初步將菌株HKD-6判定為芽孢桿菌。

表5 菌株HKD-6的生理生化實驗結果

2.2.3 分子生物學鑒定利用細菌通用引物從菌株HKD-6基因組中擴增獲得了1500 bp左右的16S rDNA基因片段，測序后于NCBI數據庫中進行Blast比對。該菌株與貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)、萎縮芽孢桿菌(B. atrophaeus)和解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)的親緣關系最近，相似性均達到99.9%以上?；?6S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）結果（圖3），將HKD-6判定為芽孢桿菌屬細菌。

圖3 基于16S rDNA序列構建的菌株HKD-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

為了進一步分析菌株HKD-6的進化地位，對該菌株的gyrA和gyrB基因分別進行PCR擴增，結果發(fā)現其基因全長分別為966和1152 bp?；诨騡yrA和gyrB構建的序列進化樹（鄰接法）結果均表明，菌株HKD-6與貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)的親緣關系最近，且處于同一分支（圖4）。

圖4 基于gyrA（A）和gyrB（B）基因序列構建的菌株HKD-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果，并結合形態(tài)學觀察結果和生理生化特征實驗結果，將菌株HKD-6鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)。

2.3 貝萊斯芽孢桿菌HKD-6的生長特性

2.3.1 HKD-6的生長曲線拮抗菌株HKD-6的生長變化趨勢如圖5所示：培養(yǎng)20 h后，HKD-6菌株結束對數生長期；培養(yǎng)20～28 h期間為穩(wěn)定生長期；培養(yǎng)28 h后進入衰退期。在培養(yǎng)時間為24 h時該菌株的生物量達到最大。

圖5 菌株HKD-6的生長曲線

2.3.2 HKD-6的耐鹽及耐pH值特性為了進一步分析菌株HKD-6對鹽濃度和pH值的耐受性，分別測定了其在0.5%～15.0% NaCl濃度、pH值為4～10的LB培養(yǎng)基中的生長狀況。從圖6可以看出：菌株HKD-6可耐受15% NaCl濃度的高鹽環(huán)境，其中在NaCl濃度為0.5%～7.0%的培養(yǎng)基上均能正常生長；同時該菌株在pH值為4～10的LB培養(yǎng)基中均可生長，其中在pH值為5～9的環(huán)境下生長良好，當pH值為6時生長狀況最好。由此可知，菌株HKD-6對環(huán)境中的鹽度和pH值均表現出較強的耐受能力。

圖6 菌株HKD-6的耐鹽及耐pH值能力

2.3.3 HKD-6與化學殺菌劑的相容性為了分析貝萊斯芽孢桿菌HKD-6與防治稻瘟病的化學殺菌劑的相容性，分別測定了福仕一號（40%稻瘟靈）和75%三環(huán)唑2種化學殺菌劑對HKD-6菌落生長的影響。由表6可見：在40%稻瘟靈濃度為0.01～2.00 mL/L范圍內，HKD-6菌株均能夠生長；當40%稻瘟靈濃度為0.01～0.50 mL/L時，該菌株的生長正?；蚵缘陀趯φ战M；當40%稻瘟靈濃度達到2.00 mL/L時，HKD-6菌株在培養(yǎng)2 d后的菌落數約為對照組的1/10，在培養(yǎng)5 d后其菌落數較之前有明顯增加，表明在該濃度下HKD-6菌株能夠繼續(xù)緩慢生長。

表6 化學殺菌劑對HKD-6菌株生長的影響

對于75%三環(huán)唑而言，當其質量濃度為50～ 500 mg/L時，拮抗菌HKD-6均能夠生長，其中在50～100 mg/L濃度下菌株生長基本正常；此后隨著濃度的增加，該菌株的菌落數逐漸下降，但在培養(yǎng)5 d后仍能保持原有的活菌數量。因此，HKD-6菌株與稻瘟靈、三環(huán)唑均具有較好的相容性。

2.4 貝萊斯芽孢桿菌HKD-6的抑菌物質

2.4.1 抗生素合成相關基因的檢測以HKD-6菌株的基因組DNA為模板，分別對已報道的芽孢桿菌中7種抗生素合成相關基因進行PCR擴增，其中包括表面活性素Surfactin的合成相關基因sfrAB、伊枯草菌素Iturin的合成相關基因ituC、豐原素Fengycin的合成相關基因fenD、溶桿菌素Bacylisin的合成相關基因bacA、桿菌霉素Bacillomycin的合成相關基因bamC、抗霉枯草菌素的合成相關基因mycB以及抑菌相關假定蛋白基因yndJ。PCR擴增結果如圖7所示，從拮抗菌株HKD-6的基因組中可以擴增出上述7種目的基因，表明該菌株具有產生這7種脂肽類抗生素的潛力。

圖7 HKD-6抗生素合成相關基因的PCR凝膠電泳結果

2.4.2 細胞壁降解酶編碼基因的檢測使用設計的5對引物（表3）對真菌細胞壁相關降解酶編碼基因進行PCR擴增，包括1種葡聚糖酶、3種幾丁質酶和1種蛋白酶編碼基因。PCR擴增結果如圖8所示，除了沒有擴增出幾丁質酶中gh18-1和蛋白酶qk基因的特異性條帶外，其余3對基因(bglu1、ydhD、YaaH)的引物均可以擴增出單一明亮條帶，且條帶的大小與理論大小一致。經測序，證實這3對引物的擴增產物均與對應的目標基因一致，說明HKD-6菌株具有合成葡聚糖酶和幾丁質酶的潛力。

圖8 HKD-6中細胞壁降解酶編碼基因的PCR結果

2.4.3 胞外酶活性的檢測菌株HKD-6胞外酶活性的檢測結果（圖9）顯示：在蛋白酶、葡聚糖酶檢測平板上均可產生明顯的透明圈，表明該菌株可以分泌蛋白酶和葡聚糖酶；但在幾丁質酶檢測平板上沒有產生可見的透明圈，表明該菌株不能向胞外分泌幾丁質酶。

圖9 拮抗菌株HKD-6胞外酶活性的檢測結果

3 討論

篩選并利用高效生防菌株抑制稻瘟病菌，已成為水稻稻瘟病防治的研究熱點。貝萊斯芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的1個新成員，近年來已被證實在多種植物病害防治中表現出良好的效果，包括條斑病［15］、枯萎?。?9-20］、稻瘟?。?3］和白絹病［18］等。李生樟等［15］從空心菜根際土壤中篩選得到的貝萊斯芽孢桿菌504對水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo)具有顯著的抑菌效果。萬青等［19-20］分離得到的貝萊斯芽孢桿菌B18、YX-11對香蕉枯萎病病原菌Foc4均表現出明顯的拮抗作用，在盆栽試驗中的防效均達到64%以上。李界秋等［18］測定的6株貝萊斯芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌等6種土傳病原菌均表現出抑菌活性。沙月霞等［13］從水稻葉片分離得到的E69菌株，除對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌等多種病原菌具有拮抗作用外，對稻瘟病菌也表現出顯著的抑制作用，在溫室條件下測定其對稻瘟病的預防效果，達83.24%。因此，貝萊斯芽孢桿菌在水稻稻瘟病防治中具有較大的應用潛力。

雖然已有多種貝萊斯芽孢桿菌被發(fā)現并用于多種植物病害的生物防治，但是由其制成的生防菌劑仍然不能滿足市場的需求，且對貝萊斯芽孢桿菌抑菌機制的探討也尚不深入。國內外研究發(fā)現，芽孢桿菌屬細菌的抑菌機制主要包括拮抗、營養(yǎng)和空間競爭等，其中拮抗作用的產生與其合成和分泌的抑菌物質密切相關［7,21］。

以表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和豐原素(Fengycin)為代表的脂肽類抗生素，能夠破壞致病真菌的細胞壁和細胞膜，從而抑制病原真菌菌絲的生長和發(fā)育［8］。李生樟等［15,18］均發(fā)現貝萊斯芽孢桿菌基因組中含有與豐原素、表面活性素、伊枯草菌素等多種脂肽類物質合成相關的基因片段。Chowdhury等［22］發(fā)現貝萊斯芽孢桿菌FZB42（原解淀粉芽孢桿菌）能夠在萵苣根際土壤中分泌表面活性素、豐原素和桿菌霉素D，除直接抑制立枯絲核菌的生長外，還能夠誘導萵苣防御素基因PDF 1.2的上調表達，增強其對病原菌的免疫反應。Gao等［23-25］均證實貝萊斯芽孢桿菌分泌的伊枯草菌素、豐原素等抗菌物質能夠破壞植物病原菌的細胞膜結構，造成菌絲的扭曲、腫大和畸形，進而導致細胞裂解死亡。

此外，以蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶為代表的水解酶，可被芽孢桿菌分泌到胞外，對真菌的細胞壁進行降解破壞，從而達到抑制病原菌生長的目的［21］。李界秋等［18,26-27］均證實了貝萊斯芽孢桿菌具有分泌蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶等胞外酶的能力。王偉等［28］從貝萊斯芽孢桿菌12-51菌株發(fā)酵液中初步分離得到了蛋白類抗菌物質組分，證實其對大麗輪枝菌具有拮抗活性。Xu等［29］從貝萊斯芽孢桿菌ZJ20中克隆獲得了1個β-1，3-葡聚糖酶，發(fā)現其重組蛋白能夠破壞栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、紫卷擔子菌(Helicobasidium purpureum)和桉樹焦枯病菌(Cylindrocladium quinqueseptatum)這3種植物病原菌的菌絲形態(tài)。

開展貝萊斯芽孢桿菌對稻瘟病菌的抑菌機制研究，對指導水稻稻瘟病的生物防治具有重要意義。本實驗從貝萊斯芽孢桿菌HKD-6基因組中擴增出了與脂肽類抗生素合成相關的基因srfAB、fenD、ituC、bacA、bamC、mycB和yndJ，表明該菌株具有產生芽孢桿菌類典型脂肽類抗生素的潛力。同時，該菌株的基因組亦含有葡聚糖酶和幾丁質酶的編碼基因，但酶活平板檢測發(fā)現僅有蛋白酶和葡聚糖酶被分泌到胞外，可能直接參與致病真菌細胞壁的降解。然而究竟哪些活性成分在抑制稻瘟病菌過程中發(fā)揮主要作用，以及抑菌物質的作用靶點和方式，仍有待于今后深入研究。

除了產生的抑菌物質外，生防菌株防治效果的發(fā)揮還依賴于菌體在復雜外界環(huán)境中的存活和定殖。本實驗發(fā)現貝萊斯芽孢桿菌HKD-6對防治稻瘟病的常用化學殺菌劑具有良好的相容性，且能耐受較高濃度的鹽和較寬范圍的pH值，這有利于該拮抗菌株在各種環(huán)境中定殖以及實現與化學殺菌劑的聯合使用，因此貝萊斯芽孢桿菌HKD-6具有預防大田稻瘟病的潛力。今后應進一步對貝萊斯芽孢桿菌HKD-6的施用方式進行研究，并評價其與其他化學殺菌劑、菌劑和肥料的協(xié)同效果，以期為稻瘟病生防菌劑的開發(fā)和應用提供更多的數據支撐。