快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估技術(shù)在診斷性介入呼吸病學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展▲

譚小玉 黎雨 李文濤 陳俊健 方妮

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧市 530007

【提要】 快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估(ROSE)技術(shù)是一項(xiàng)主要以細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)和微生物學(xué)為基礎(chǔ)，在操作現(xiàn)場(chǎng)迅速對(duì)標(biāo)本開(kāi)展制片和染色，以及評(píng)價(jià)和判斷的診斷技術(shù)。在呼吸介入診療和呼吸疾病診斷中，免疫熒光標(biāo)記染色ROSE技術(shù)的靈敏度和特異度較傳統(tǒng)ROSE技術(shù)高，本文就介入呼吸病學(xué)ROSE技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估(rapid on-site examination, ROSE)是用穿刺、活檢、刷片等辦法收集標(biāo)本，并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行快速制片和染色，隨后現(xiàn)場(chǎng)利用顯微鏡對(duì)標(biāo)本進(jìn)行快速評(píng)價(jià)、分流和初步診斷，以指引下一步檢查操作的一項(xiàng)診斷技術(shù)[1]。1990年Davenport報(bào)告在氣管鏡活檢過(guò)程中應(yīng)用ROSE技術(shù)可以提高肺惡性腫瘤活檢組織的合格率，從而提高疾病的診斷率[2]。運(yùn)用ROSE技術(shù)除可提升活檢標(biāo)本的合格率外，還可減少活檢次數(shù)和操作時(shí)間，且能提供早期診斷根據(jù)。最近10年，由于肺結(jié)節(jié)和肺癌、呼吸疑難病與危重癥感染等早期診治的迫切需要，以及介入呼吸病學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用和不斷更新發(fā)展，ROSE技術(shù)在呼吸介入診療中得到蓬勃發(fā)展，在肺、甲狀腺、腮腺、胰腺和縱隔淋巴結(jié)等組織診斷中發(fā)揮了重要作用[3-16]?，F(xiàn)對(duì)診斷性介入呼吸病學(xué)的ROSE技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ROSE的分類及其臨床價(jià)值

ROSE為伴隨介入技術(shù)發(fā)展起來(lái)的診斷技術(shù)，分為現(xiàn)場(chǎng)細(xì)胞學(xué)評(píng)估(cytological ROSE，C-ROSE )與現(xiàn)場(chǎng)微生物學(xué)評(píng)估(microbiological ROSE，M-ROSE)兩部分，C-ROSE主要用于判斷細(xì)胞良、惡性，M-ROSE主要用于微生物評(píng)價(jià)，兩者密不可分[14]。C-ROSE的主要臨床價(jià)值包括：(1)實(shí)時(shí)指導(dǎo)經(jīng)氣管鏡支氣管肺泡灌洗、經(jīng)支氣管鏡肺活檢、刷檢、黏膜活檢、經(jīng)支氣管鏡細(xì)針吸引活檢、經(jīng)皮肺活檢、胸膜活檢、經(jīng)胸腔鏡胸膜活檢，以及其他部位(如皮下或深在部位)針吸脫落細(xì)胞學(xué)等檢查的開(kāi)展。(2)在進(jìn)行各類經(jīng)氣管鏡介入治療(高頻電刀、氬等離子電凝、冷凍切除、光動(dòng)力治療、微波治療、激光治療等)過(guò)程中，指引介入呼吸病學(xué)治療的進(jìn)程和判斷介入呼吸病學(xué)治療效果。(3)經(jīng)呼吸內(nèi)鏡確定肺部腫瘤外科手術(shù)切除范圍。M-ROSE的主要臨床價(jià)值包含：(1)根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，初步辨別部分微生物病原，如念珠菌屬、曲霉菌屬、耶氏肺孢子菌、隱球菌和其他類型真菌、病毒包涵體、球菌和桿菌。(2)可現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)反復(fù)取材，保證檢材性標(biāo)本量。(3)根據(jù)細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)及其比例等細(xì)胞學(xué)背景，粗略區(qū)分感染性疾病和非感染性疾病，從而制定初步治療的策略，并能夠預(yù)估病情嚴(yán)重程度和預(yù)判療效。

2 傳統(tǒng)ROSE技術(shù)

ROSE可安排在手術(shù)室、呼吸內(nèi)鏡室、重癥監(jiān)護(hù)室等場(chǎng)所進(jìn)行，不受場(chǎng)地限制。所需要的設(shè)備和材料比較簡(jiǎn)單，包括玻片、染液和顯微鏡。關(guān)鍵步驟是應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡立刻對(duì)標(biāo)本進(jìn)行觀察和判讀，因此光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡的配置是關(guān)鍵，還可配置高清的圖文采集系統(tǒng)和打印設(shè)備，以利于出具報(bào)告。

ROSE操作分三步驟依序進(jìn)行，首先是制片，接著是染色，最后是判讀。常用的制片辦法有活檢組織塊滾片(印片) 法、細(xì)胞刷涂抹(刷片)法、噴片法與噴射推片法、液基薄層細(xì)胞制片法、微孔濾膜過(guò)濾法等。制片時(shí)需注意厚度適中，涂片均勻。制片結(jié)束后，依據(jù)實(shí)際情況選擇合適的染色方法，立刻開(kāi)展快速染色?？焖偃旧胧┯泻芏喾N，現(xiàn)常用的快速染色方案有以下3種：(1)迪夫快速染色[17]，適用于穿刺組織、血液、體液等標(biāo)本的染色。(2)極快速改良瑞氏染色，可通用于絕大多數(shù)C-ROSE與M-ROSE的染色[13]。(3)改良快速巴氏染色，一種比較常用的快速染色方法，雖然其靈敏度和特異度都較極快速改良瑞氏染色高[18]，但染色時(shí)間較久，大概為3 min，而且操作需15個(gè)步驟，相對(duì)繁雜；在C-ROSE過(guò)程中往往需要專業(yè)技師的幫助，一定程度上限制其使用[19]。其他的快速染色法[13]：極快速改良乳酸染色(改良乳酸酚棉蘭染色)，主要用于判斷真菌感染；快速支原體DNA霍氏熒光染色，主要應(yīng)用于判斷支原體感染；快速金-羅耐酸菌熒光染色(也叫金胺O-羅丹明熒光染色)，染色呈強(qiáng)陽(yáng)性為結(jié)核分枝桿菌和努卡菌，染色呈弱陽(yáng)性為軍團(tuán)菌；試劑盒化快速革蘭染色，主要應(yīng)用于判斷球菌和桿菌。

染色完成后，清洗玻片，用吸水紙吸干存留玻片上的染液或水分，玻片放置于顯微鏡，現(xiàn)場(chǎng)在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察，在最短時(shí)間內(nèi)對(duì)鏡下所看到的細(xì)胞形態(tài)、排列特點(diǎn)和周圍細(xì)胞背景等進(jìn)行初步認(rèn)定，并迅速判讀獲得結(jié)果，從而根據(jù)結(jié)果指導(dǎo)介入操作的進(jìn)程。閱片者往往需要密切結(jié)合臨床資料，綜合應(yīng)用微生物學(xué)、影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)等多學(xué)科知識(shí)，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行判讀。閱片者既可以是病理科、檢驗(yàn)科醫(yī)師，也可以是臨床醫(yī)師，要求其受過(guò)系統(tǒng)培訓(xùn)，并具備豐富的經(jīng)驗(yàn)。首先判斷標(biāo)本是否合格：如觀察到出血、壞死或黏液狀的物質(zhì)，有效細(xì)胞成分少，則提示取材不理想，需實(shí)時(shí)調(diào)整取材位置或取材方法，直至取材成功。若已取得理想標(biāo)本則可結(jié)束操作。取材成功后根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)快速判讀結(jié)果進(jìn)行標(biāo)本分流，如果現(xiàn)場(chǎng)見(jiàn)到異形細(xì)胞，則初步判斷是否為惡性細(xì)胞、可疑惡性細(xì)胞，考慮行免疫組化或腫瘤基因檢查，并指導(dǎo)進(jìn)一步取材；如現(xiàn)場(chǎng)判斷化膿性病變或見(jiàn)到細(xì)菌吞噬，初步判斷是否為感染性疾病，考慮行病原學(xué)相關(guān)檢查和微生物宏基因檢測(cè)。

ROSE在介入操作方面具有很多優(yōu)勢(shì)：(1)提高取材診斷陽(yáng)性率，特別是對(duì)病灶小、取材難的病變組織；(2)減少介入操作次數(shù)，降低操作并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；(3)對(duì)疑難和危重癥患者，ROSE結(jié)果可用于指導(dǎo)標(biāo)本的進(jìn)一步處置和特殊檢查，為早期診斷、早期治療提供客觀根據(jù)；(4)在多學(xué)科聯(lián)合診斷技術(shù)中性價(jià)比高，有助于惡性腫瘤的診斷和標(biāo)本的分流[20]，如用于快速染色的肺癌組織檢材可直接用于二代基因測(cè)序[21]。ROSE除了在早期可指導(dǎo)區(qū)別惡性、良性病變外，在鑒別部分變態(tài)反應(yīng)性疾病(如嗜酸性粒細(xì)胞性支氣管炎和哮喘、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥)、呼吸系統(tǒng)感染性疾病(炎癥細(xì)胞增多)等方面也具有重要作用。

關(guān)于傳統(tǒng)ROSE技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值和局限性，有學(xué)者認(rèn)為：ROSE操作需要操作者具備較強(qiáng)的細(xì)胞病理學(xué)知識(shí)儲(chǔ)備，不應(yīng)該由臨床醫(yī)師開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)染色、讀片判斷[22]；不合格的ROSE診斷有可能導(dǎo)致穿刺提前結(jié)束，導(dǎo)致活檢不成功，有研究結(jié)果顯示ROSE并不能提高經(jīng)支氣管鏡針吸活檢的診斷率[23]。此外，由于受限于染色方法，且操作者經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)水平參差不齊，ROSE判讀結(jié)果差異大。同時(shí)，操作人員快速識(shí)別形態(tài)學(xué)也有難度，存在一定的主觀誤差，并不能確診，所以ROSE結(jié)果所能提供的信息也是局限的[22]。

3 免疫熒光標(biāo)記染色ROSE技術(shù)

鑒于以上傳統(tǒng)ROSE技術(shù)的不足，ROSE診斷創(chuàng)新(免疫熒光標(biāo)記染色ROSE技術(shù))應(yīng)運(yùn)而出：從ROSE操作過(guò)程中的染色方法方面尋找新的突破口，將免疫熒光染色法的理念引入、融合到傳統(tǒng)ROSE技術(shù)中，結(jié)合其他新的介入診療手段，提高基于ROSE技術(shù)的呼吸介入診斷的靈敏度和特異度?！睹绹?guó)傳染病微生物實(shí)驗(yàn)室診斷方法使用指南》[24]中指出，免疫熒光染色法是診斷真菌引起的血液、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼部、頭頸部軟組織、呼吸道、胃腸道、腹腔、骨和關(guān)節(jié)、泌尿道、生殖器、皮膚和軟組織等的感染最為可靠的方法[24]。中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理分會(huì)第二十五次學(xué)術(shù)會(huì)議提出，抗酸分枝桿菌熒光染色法診斷兒童結(jié)核病感染的靈敏度和特異度更高。肺結(jié)核診斷行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS288-2017中增加了熒光染色顯微鏡檢查和兒童肺結(jié)核診斷特點(diǎn)內(nèi)容[25]，能夠更好地為結(jié)核感染患兒的確診提供指導(dǎo)依據(jù)。熒光染色檢測(cè)法用于惡性腫瘤診斷方面的研究[26-27]逐漸受到關(guān)注。傳統(tǒng)ROSE技術(shù)流程繁多，操作復(fù)雜，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速精確診斷。采用蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)可一步染色操作，1 min內(nèi)對(duì)各類組織和細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行染色診斷。

免疫熒光染色法主要分三部分：真菌熒光染色(對(duì)各類組織和細(xì)胞標(biāo)本中存在的真菌進(jìn)行基礎(chǔ)菌屬分類)、抗酸熒光染色(對(duì)各類組織和細(xì)胞標(biāo)本中存在的抗酸桿菌進(jìn)行特異性標(biāo)記)、組織細(xì)胞熒光染色(對(duì)各類細(xì)胞標(biāo)本中存在的病變細(xì)胞進(jìn)行快速提示，區(qū)分炎癥細(xì)胞、正常非變異細(xì)胞、變異異常細(xì)胞)。熒光染色試劑包括：(1)免疫顯色試劑(I型)，用于對(duì)組織和細(xì)胞標(biāo)本中各類真菌進(jìn)行熒光染色標(biāo)記，一步染色，1 min鏡下觀察，根據(jù)形態(tài)進(jìn)行部分菌屬區(qū)分。(2)抗酸分枝桿菌檢測(cè)試劑，用于對(duì)組織和細(xì)胞標(biāo)本中的抗酸桿菌進(jìn)行熒光染色標(biāo)記，二步染色，15 min鏡下觀察，標(biāo)本無(wú)須加熱，高度背景反差極易發(fā)現(xiàn)抗酸分枝桿菌。(3)組織細(xì)胞染色液，用于對(duì)組織和細(xì)胞進(jìn)行熒光染色標(biāo)記，一步染色，1 min鏡下觀察，能針對(duì)細(xì)胞類型和清晰的細(xì)胞學(xué)背景進(jìn)行迅速歸類。熒光染色試劑無(wú)毒、無(wú)味、無(wú)揮發(fā)性，常溫避光保存即可。醫(yī)務(wù)人員可在熒光生物顯微鏡下對(duì)熒光染色后的標(biāo)本進(jìn)行快速判讀，并現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)。

與傳統(tǒng)ROSE技術(shù)相比，免疫熒光標(biāo)記染色ROSE技術(shù)有以下優(yōu)勢(shì)：(1)熒光快速染色技術(shù)操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，符合快速研判診斷、快速出報(bào)告的要求。(2)熒光顯色，靈敏度高，減少漏診發(fā)生。(3)特異性熒光標(biāo)記，形態(tài)確切，特異度高，減少假陽(yáng)性，臨床符合率高。(4)一份標(biāo)本可同時(shí)完成多種檢測(cè)，減少臨床反復(fù)取材，可提示真菌、結(jié)核桿菌、球菌、桿菌和異常病變細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、上皮細(xì)胞。

4 小結(jié)與展望

傳統(tǒng)染色ROSE技術(shù)的應(yīng)用推進(jìn)了呼吸介入診斷技術(shù)的快速發(fā)展，免疫熒光標(biāo)記染色ROSE技術(shù)也逐漸突顯優(yōu)勢(shì)，基于免疫熒光檢測(cè)方法的全自動(dòng)熒光圖像掃描儀(包括有單通量熒光自動(dòng)型、多通量熒光自動(dòng)型)可自動(dòng)掃描判斷，加上在人工智能醫(yī)療領(lǐng)域的全方位研究，實(shí)現(xiàn)了深度學(xué)習(xí)、計(jì)算機(jī)視覺(jué)、光電控制等開(kāi)創(chuàng)性的技術(shù)突破。其中NGMAX采用獨(dú)創(chuàng)的算法模型，結(jié)合自動(dòng)化掃描設(shè)備，形成了一站式軟硬件一體輔助診斷解決方案，用于實(shí)現(xiàn)呼吸道病原體和細(xì)胞學(xué)熒光下人工智能篩查與診斷，準(zhǔn)確率突破98%，便于臨床解決更多的疑難雜癥和新的診斷技術(shù)挑戰(zhàn)。自動(dòng)化制片與自動(dòng)化染色的研究目前正在開(kāi)展中，不久的將來(lái)，隨著人工智能技術(shù)的快速發(fā)展，有望實(shí)現(xiàn)ROSE技術(shù)全自動(dòng)化，推進(jìn)ROSE技術(shù)應(yīng)用的飛躍變革。