亮菌甲素注射劑雜質(zhì)譜研究

尹 菁，薛敏華，康麗潔，石蓓佳，陸益紅*

1 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019；2 阜陽(yáng)市第五人民醫(yī)院，安徽阜陽(yáng) 236063

亮菌甲素又稱假蜜環(huán)菌甲素，是一種香豆素類化合物，具有利膽解痙、松弛膽道末端括約肌作用，臨床作為利膽藥[1]。其劑型有片劑、注射劑。亮菌甲素、注射用亮菌甲素及亮菌甲素注射液的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》[2-4]，其中亮菌甲素原料藥采用TLC 法控制有關(guān)物質(zhì)，注射用亮菌甲素及亮菌甲素注射液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未設(shè)置有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)；亦有注射用亮菌甲素執(zhí)行企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)[國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（試行）YBH08512006]，有關(guān)物質(zhì)檢查未擬定有效的系統(tǒng)適用性指標(biāo)，難以確保雜質(zhì)峰的有效分離與檢出[5]。目前尚未見關(guān)于亮菌甲素雜質(zhì)譜的研究報(bào)道。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，運(yùn)用強(qiáng)制降解試驗(yàn)，建立了亮菌甲素注射劑雜質(zhì)譜，對(duì)10個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析并推測(cè)雜質(zhì)來(lái)源。此外，采用ADMET Predictor 軟件對(duì)亮菌甲素及其雜質(zhì)進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，為亮菌甲素的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Acquity UPLC I CLASS，Xevo G2-XS Q-TOF液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（MassLynx V4.1/UNIFI 分析軟件，美國(guó)Waters 公司）；高效液相色譜儀LC-20AD，SPD-M20A 檢測(cè)器（日本Shimadzu 公司）；Mettler Toledo XS205 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，感量：0.01mg）；SevenMulti 型pH 計(jì)（瑞士Mettler Toledo 公司）；7.2.0001 型DMET Predictor 藥物預(yù)測(cè)軟件（美國(guó)Simulation Plus 有限公司）。

1.2 藥品與試劑

亮菌甲素原料（a 廠，批號(hào)20150927）；注射用亮菌甲素（b 廠，批號(hào)：17041222、18011132、18031113），亮菌甲素注射液（c 廠，批號(hào)：1702102、1702112、1702122）；乙酸銨、乙酸、氫氧化鈉等為分析純；鹽酸、30%過(guò)氧化氫為市售品；甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.01 mol·L-1乙酸銨溶液（用乙酸調(diào)pH 至4.0）為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～20 min B 由10%升至40%，20～40 min B 由40%升至60%，40～50 min B 保持60%，50～51 min B 降至10%，51～65 min B 保持10%；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（ESI-）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV/2.5 kV；源溫度：120 ℃；霧化氣流速：1000 L·h-1；霧化氣溫度：500 ℃；采集模式：MSE（全信息串聯(lián)質(zhì)譜）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液避光操作。①亮菌甲素原料：稱取10 mg 置于20 mL 量瓶，用甲醇溶解，加水稀釋至刻度，搖勻；②注射用亮菌甲素：取本品，用水溶解并稀釋制成每1 mL 中約含亮菌甲素0.5 mg的溶液；③亮菌甲素注射液：取本品進(jìn)樣分析。

2.3.2 亮菌甲素原料強(qiáng)制降解試驗(yàn)①酸破壞：稱取亮菌甲素10 mg 置于20 mL 量瓶，加1 moL·L-1鹽酸2 mL，室溫暗處放置1 h，用1 moL·L-1氫氧化鈉調(diào)至中性，加甲醇溶解，用水稀釋并定容，搖勻。②堿破壞：稱取亮菌甲素10 mg 置于20 mL 量瓶，加0.1 moL·L-1氫氧化鈉2 mL，室溫暗處放置30 min，用0.1 moL·L-1鹽酸調(diào)至中性，加甲醇溶解，用水稀釋并定容，搖勻。③氧化破壞：稱取亮菌甲素10 mg置于20 mL 量瓶，加30%過(guò)氧化氫溶液2 mL，室溫暗處放置1 h，加甲醇溶解，用水稀釋并定容，搖勻。④高溫破壞：稱取亮菌甲素10 mg 置于20 mL 量瓶，于60 ℃烘箱放置10 天，取出至室溫，加甲醇溶解，用水稀釋并定容，搖勻。⑤光照破壞：稱取亮菌甲素10 mg 置于20 mL 量瓶，加甲醇溶解，用水稀釋并定容，搖勻，置強(qiáng)光下照射2 h，照度（4500±500）Lx。

2.4 雜質(zhì)毒性預(yù)測(cè)

使用Chemdraw 軟件畫出亮菌甲素及各雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式并保存為“.mol”或“.sdf”格式，導(dǎo)入ADMET Predictor 軟件，對(duì)亮菌甲素及各雜質(zhì)的毒性作出預(yù)測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 亮菌甲素雜質(zhì)譜的建立

對(duì)b、c 廠生產(chǎn)的亮菌甲素注射劑進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，典型色譜圖見圖1A、B。取“2.3.2”項(xiàng)下各溶液進(jìn)樣分析，典型色譜圖見圖1C。強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果表明，亮菌甲素在堿性條件下極不穩(wěn)定，在光照條件也不穩(wěn)定。在選定的色譜條件下，各雜質(zhì)色譜分離良好。將原料、制劑中存在的雜質(zhì)以及強(qiáng)制降解試驗(yàn)產(chǎn)生的的主要雜質(zhì)匯總，并繪制成亮菌甲素的雜質(zhì)譜，見圖2。10 個(gè)主要雜質(zhì)峰按保留時(shí)間順序編號(hào)為雜質(zhì)1～10，其中雜質(zhì)1～5 為堿降解雜質(zhì)，雜質(zhì)6、7 為光降解雜質(zhì)，雜質(zhì)8 為原料引入的，雜質(zhì)9、10 為亮菌甲素注射液特有的雜質(zhì)。

圖1 亮菌甲素注射劑有關(guān)物質(zhì)及原料降解試驗(yàn)色譜圖

圖2 合成的亮菌甲素雜質(zhì)譜

3.2 亮菌甲素注射劑中主要雜質(zhì)LC-MS 分析

根據(jù)質(zhì)譜信息，采用Masslynx V4.1/NNIFI 軟件中的化合物結(jié)構(gòu)解析工具預(yù)測(cè)雜質(zhì)分子式，作元素分析及化合物鑒定；參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]并依據(jù)各雜質(zhì)來(lái)源及亮菌甲素裂解規(guī)律，推定各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)[7]。該品雜質(zhì)譜中10 個(gè)雜質(zhì)質(zhì)譜信息與推測(cè)結(jié)構(gòu)見表1，圖3。

圖3 亮菌甲素的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式

表1 亮菌甲素雜質(zhì)質(zhì)譜信息與推測(cè)的結(jié)構(gòu)

3.2.1 亮菌甲素裂解途徑推測(cè)亮菌甲素的[M-H]-分子離子為m/z 233，主要的二級(jí)碎片離子m/z 203，m/z 191，m/z 161，m/z 133，m/z 119。先通過(guò)丟失苯環(huán)上的羥甲基形成碎片離子m/z 203 [M-HCH2O]-，或通過(guò)丟失內(nèi)酯環(huán)上的乙?；纬伤槠x子m/z 191[M-H-C2H2O]-，若同時(shí)通過(guò)丟失苯環(huán)上的羥甲基和內(nèi)酯環(huán)上的乙?；?，則形成碎片離子m/z 161[M-H-CH2O-C2H2O]-，最后通過(guò)丟失內(nèi)酯環(huán)中一分子CO 形成碎片離子m/z 133[M-H-CH2O-C2H2OCO]-，或通過(guò)丟失內(nèi)酯環(huán)中一分子CO2形成碎片離子m/z 119[M-H-CH2O-C2H2O-CO2]-。根據(jù)其典型的碎片離子推測(cè)亮菌甲素質(zhì)譜裂解途徑，見圖4。

圖4 亮菌甲素質(zhì)譜裂解途徑推測(cè)

3.2.2 雜質(zhì)裂解途徑推測(cè)①雜質(zhì)1 的結(jié)構(gòu)分析：雜質(zhì)1 的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z 209，軟件推測(cè)分子式為C10H10O5。其二級(jí)碎片離子與亮菌甲素不一致，說(shuō)明其基本母核與亮菌甲素不同。雜質(zhì)1的質(zhì)量比亮菌甲素少24，結(jié)合雜質(zhì)1 的來(lái)源，推測(cè)雜質(zhì)1 是由亮菌甲素堿破壞導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)斷開進(jìn)而丟失2C。碎片離子m/z 165 是由母離子m/z 209 苯環(huán)上取代基側(cè)鏈丟失一分子CO2形成的；碎片離子中有m/z 135，說(shuō)明苯環(huán)上有羥甲基；該離子進(jìn)一步丟失甲基形成碎片離子m/z 121，最后形成穩(wěn)定的碎片離子m/z 91。因此，雜質(zhì)1 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑推測(cè)見圖5。

圖5 雜質(zhì)1 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

②雜質(zhì)2 的結(jié)構(gòu)分析：雜質(zhì)2 的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z 167，二級(jí)碎片離子與亮菌甲素不同，說(shuō)明其基本母核與亮菌甲素不同。雜質(zhì)2 的質(zhì)量比亮菌甲素少66，結(jié)合雜質(zhì)2 的來(lái)源及分子式預(yù)測(cè)為C8H8O4，推測(cè)雜質(zhì)2 是由亮菌甲素內(nèi)酯環(huán)斷開后丟失4C 和一個(gè)中性分子H2O 形成的。m/z 149 是由[C8H8O4]-發(fā)生C-O鍵斷裂丟失一個(gè)中性分子H2O 形成的，再通過(guò)丟失甲?；纬蒣C7H5O2]-碎片離子m/z 121；m/z 139 是由[C8H8O4]-丟失醛基形成的，進(jìn)而發(fā)生C-O 鍵斷裂形成[C7H5O2]-碎片離子m/z 121；最后[C7H5O2]-丟失一個(gè)中性CO 分子得到碎片離子m/z 93。雜質(zhì)2 結(jié)構(gòu)及推測(cè)的質(zhì)譜裂解途徑見圖6。

圖6 雜質(zhì)2 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

③雜質(zhì)3 的結(jié)構(gòu)分析：雜質(zhì)3 的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z 207，二級(jí)碎片離子中m/z 149，m/z 139，m/z 121，m/z 93 與雜質(zhì)2 相同，其基本母核可能與雜質(zhì)2 一致，即亮菌甲素中內(nèi)酯環(huán)斷開，這與雜質(zhì)3 是由亮菌甲素經(jīng)堿破壞或高溫破壞得到的一致。雜質(zhì)3 的質(zhì)量比雜質(zhì)2 多40，碎片離子中有m/z 165 但是沒(méi)有m/z 167，推測(cè)雜質(zhì)3 苯環(huán)側(cè)鏈有乙酰基；結(jié)合雜質(zhì)3 的來(lái)源及Masslynx V4.1/NNIFI軟件分析結(jié)果，推測(cè)雜質(zhì)3 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖7。

圖7 雜質(zhì)3 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

④雜質(zhì)4 的結(jié)構(gòu)分析：雜質(zhì)4 的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z 233，分子式預(yù)測(cè)結(jié)果為C12H10O5；雜質(zhì)4 的一級(jí)質(zhì)譜信息與亮菌甲素基本一致，推測(cè)為亮菌甲素的同分異構(gòu)體，但其二級(jí)質(zhì)譜信息與亮菌甲素不相似，推測(cè)其空間結(jié)構(gòu)可能與亮菌甲素不同。由于亮菌甲素母核有內(nèi)酯環(huán)，在堿性條件下易發(fā)生水解、內(nèi)酯環(huán)斷開，加酸中和后內(nèi)酯環(huán)重新環(huán)合；若羧基與苯環(huán)上鄰位羥基脫水環(huán)合則形成亮菌甲素的內(nèi)酯環(huán)，推測(cè)雜質(zhì)4 的內(nèi)酯環(huán)是由羧基與鄰位羥甲基上的羥基脫水環(huán)合形成的。因此，推測(cè)雜質(zhì)4 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖8。

圖8 雜質(zhì)4 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

⑤雜質(zhì)5 的結(jié)構(gòu)分析：雜質(zhì)5 的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z 251，分子式預(yù)測(cè)結(jié)果為C12H12O6；其二級(jí)碎片離子與亮菌甲素不一致，說(shuō)明其基本母核與亮菌甲素不同。雜質(zhì)5 的質(zhì)量比亮菌甲素多18，推測(cè)其結(jié)構(gòu)中引入H2O；雜質(zhì)5 二級(jí)碎片離子中m/z 207 是由母離子丟失羧基形成的，進(jìn)一步發(fā)生CO 鍵斷裂丟失一個(gè)中性H2O 分子，同時(shí)丟失乙酰基后形成碎片離子m/z 147，該碎片離子再丟失一個(gè)中性CO 分子形成碎片離子m/z 119，最后失去氧原子形成碎片離子m/z 103。結(jié)合Masslynx V4.1/NNIFI 軟件分析結(jié)果，推測(cè)雜質(zhì)5 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖9。

圖9 雜質(zhì)5 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

⑥雜質(zhì)6、雜質(zhì)7 的結(jié)構(gòu)分析：雜質(zhì)6、7 的[MH]-準(zhǔn)分子離子峰m/z 均為465，軟件推測(cè)分子式為C24H18O10，且雜質(zhì)6、7 的一級(jí)質(zhì)譜信息相似，推測(cè)雜質(zhì)6、7 互為為同分異構(gòu)體[8]。但雜質(zhì)6 與雜質(zhì)7 的二級(jí)質(zhì)譜信息不一致，推斷這兩個(gè)雜質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不同；結(jié)合強(qiáng)制降解試驗(yàn)，表明雜質(zhì)6、7 為光降解雜質(zhì)，推測(cè)未知雜質(zhì)6、7 為亮菌甲素二聚體；根據(jù)化合物極性關(guān)系及洗脫順序，推斷雜質(zhì)6 極性較雜質(zhì)7 大，故先被洗脫出峰。故雜質(zhì)6、雜質(zhì)7 結(jié)構(gòu)及推測(cè)的質(zhì)譜裂解過(guò)程見圖10 和圖11。

圖10 雜質(zhì)6 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

圖11 雜質(zhì)7 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

⑦雜質(zhì)8 的結(jié)構(gòu)分析：雜質(zhì)8 的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z 233，分子式預(yù)測(cè)結(jié)果C12H10O5，推測(cè)為亮菌甲素的同分異構(gòu)體；雜質(zhì)8 與亮菌甲素的二級(jí)質(zhì)譜信息基本一致，可見雜質(zhì)8 的空間結(jié)構(gòu)與亮菌甲素相似。經(jīng)雜質(zhì)來(lái)源分析可知，雜質(zhì)8 為原料引入的。推測(cè)雜質(zhì)8 為亮菌甲素原料合成中3，5-二羥基苯甲醇與乙氧亞甲基乙酰乙酸乙酯縮合反應(yīng)的的副產(chǎn)物，結(jié)合Masslynx V4.1/NNIFI 軟件分析結(jié)果，雜質(zhì)8 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖12。

圖12 雜質(zhì)8 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

⑧雜質(zhì)9、雜質(zhì)10 的結(jié)構(gòu)分析：雜質(zhì)9、10 的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰m/z 均為291，分子式預(yù)測(cè)結(jié)果為C15H16O6；雜質(zhì)9、10 二級(jí)質(zhì)譜信息基本一致，故為同分異構(gòu)體；雜質(zhì)9、10 的質(zhì)量比亮菌甲素多58，推測(cè)其分子中引入C3H6O。雜質(zhì)9、10 為亮菌甲素注射液中特有的雜質(zhì)，推測(cè)雜質(zhì)9、10 為亮菌甲素注射液中輔料與亮菌甲素反應(yīng)的產(chǎn)物。為驗(yàn)證上述推論，稱取亮菌甲素5 mg，按處方比例，加1，2-丙二醇3 mL與水7 mL，混勻，105 ℃熱處理1 h（模擬生產(chǎn)工藝），取出至室溫。按有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件進(jìn)樣分析，在相對(duì)保留時(shí)間（RRT）1.18 和1.21 處出現(xiàn)了兩個(gè)雜質(zhì)峰，證明雜質(zhì)9、10 是亮菌甲素與輔料丙二醇在制劑過(guò)程中發(fā)生反應(yīng)所得，為工藝雜質(zhì)。雜質(zhì)9、10 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖13。

圖13 雜質(zhì)9、10 的結(jié)構(gòu)及可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.3 雜質(zhì)來(lái)源分析

結(jié)合強(qiáng)制降解試驗(yàn)、雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析結(jié)果以及生產(chǎn)工藝分析，推測(cè)各雜質(zhì)來(lái)源見表2。

表2 亮菌甲素注射劑雜質(zhì)及來(lái)源歸屬

亮菌甲素注射劑在制劑過(guò)程中，采用先在堿性條件下使亮菌甲素溶解，再用酸回調(diào)的工藝。雜質(zhì)1～5 為亮菌甲素在堿性條件下內(nèi)酯水解開環(huán)及進(jìn)一步降解產(chǎn)生的一系列雜質(zhì)。堿的強(qiáng)度以及在堿性條件下保持的時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響雜質(zhì)1～5 產(chǎn)生的量。雜質(zhì)6、7 為亮菌甲素的光降解雜質(zhì)。雜質(zhì)8 為原料引入的，推測(cè)為原料合成3，5-二羥基苯甲醇與乙氧亞甲基乙酰乙酸乙酯縮合反應(yīng)的副產(chǎn)物。雜質(zhì)9 和10為亮菌甲素注射液特有的雜質(zhì)，從LC-MS 預(yù)測(cè)的分子式推測(cè)為占處方比例30%的輔料——丙二醇與亮菌甲素反應(yīng)的產(chǎn)物。

3.4 亮菌甲素注射劑中主要雜質(zhì)毒性預(yù)測(cè)

利用ADMET Predictor 軟件對(duì)亮菌甲素及10個(gè)雜質(zhì)的ADMET 性質(zhì)做了全面評(píng)價(jià)[9]，雜質(zhì)毒理預(yù)測(cè)結(jié)果見表3。其中亮菌甲素、雜質(zhì)8 的預(yù)測(cè)毒性很低，風(fēng)險(xiǎn)很低；其他雜質(zhì)可能具有一定的潛致敏性、染色體畸變、生殖毒和肝臟不良反應(yīng)，但風(fēng)險(xiǎn)較低。

表3 ADMET Predictor 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果

4 討論

強(qiáng)制降解試驗(yàn)表明，亮菌甲素光照敏感，在強(qiáng)堿性條件下極不穩(wěn)定。兩種劑型產(chǎn)品中均未檢出光降解雜質(zhì)，說(shuō)明企業(yè)在生產(chǎn)、儲(chǔ)存過(guò)程中的避光措施合理。由于亮菌甲素在水中幾乎不溶，生產(chǎn)工藝中均是將該品溶解于堿性溶液中，再用酸調(diào)節(jié)pH，說(shuō)明控制產(chǎn)品的pH 值是制備的關(guān)鍵點(diǎn)，建議產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)盡量縮短與堿接觸的時(shí)間，嚴(yán)格控制pH。亮菌甲素注射液因輔料中使用大量的丙二醇，而產(chǎn)生了該劑型特有的雜質(zhì)9、10，應(yīng)改進(jìn)處方工藝，降低丙二醇引入的雜質(zhì)。

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，同時(shí)結(jié)合強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果以及亮菌甲素注射劑的處方和生產(chǎn)工藝，推測(cè)了亮菌甲素注射劑雜質(zhì)譜中10 個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)與來(lái)源，并用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)了10 個(gè)雜質(zhì)的毒性，為該品種的處方和生產(chǎn)工藝優(yōu)化、質(zhì)量控制及儲(chǔ)存條件提供了參考依據(jù)。