青楊天牛嗅覺相關基因的鑒定及表達譜分析

張健 謝婉瑩 董曼羽 付立波

摘要：為探討青楊天牛嗅覺基因的種類，以期為采用RNA干涉技術調控青楊天牛種群提供理論依據(jù)，采用Illumina HiSeqTM 2500測序平臺對青楊天牛的觸角進行轉錄組測序，利用BLAST同源搜索的方法鑒定嗅覺相關的基因，采用RT-PCR技術研究嗅覺相關基因的表達譜。共鑒定出青楊天牛嗅覺基因包括：43個氣味結合蛋白（OBP）、15個化學感受蛋白（CSP）、56個嗅覺受體（OR）和24個離子受體（IR）。反轉錄PCR（RT-PCR）結果表明，青楊天牛的嗅覺基因存在性別及組織器官間的特異性。

關鍵詞：青楊天牛;嗅覺基因;表達分析

中圖分類號： Q969.511.4;S186文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）04-0023-06

收稿日期：2021-03-19

基金項目：吉林省教育廳科學技術研究項目（編號：JJKH20210880KJ）;長春師范大學自然科學基金（編號：2019-12）。

作者簡介：張 ?。?981—），男，吉林長春人，博士，副教授，主要從事昆蟲學研究。E-mail：zhangjian@ccsfu.edu.cn。

通信作者：付立波，博士，教授，主要從事生理學研究。E-mail：15804303739@163.com。

昆蟲在與植物長期協(xié)同進化的過程中，形成高度特化并且靈敏的嗅覺感受系統(tǒng)以識別外界環(huán)境中的各種化學信號，并將其轉化為體內的電信號，最終指導昆蟲完成寄主選擇、求偶、交配、產(chǎn)卵、躲避天敵等一系列的行為[1-2]。參與昆蟲嗅覺識別的蛋白質，主要包括：氣味結合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）、氣味受體（odorant receptors，ORs）、化學感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、感覺神經(jīng)膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）、離子型受體（ionotropic receptors，IRs）、氣味降解酶（odorant-degrading enzymes，ODEs）等[3-4]。

青楊天牛（Saperda populnea）隸屬鞘翅目（Coleoptera）、天?？疲–erambycidae）、溝脛天牛亞科（Lamiinae）、楔天牛屬（Saperda），又名青楊楔天牛[5]，廣泛分布于我國的北方地區(qū)，是我國重要的森林防治檢疫對象，主要危害楊屬（Populus）和柳屬（Salix）的林木[6]。青楊天牛的幼蟲主要鉆蛀幼齡楊樹的枝干，受害部位形成紡錘狀的蟲癭，阻礙楊樹養(yǎng)分的正常運輸，造成枝梢干枯，易遭風折，如危害在幼樹主干髓部，可造成整株枯萎死亡[7]。由于天牛體表具有較為堅硬的鞘翅，傳統(tǒng)的化學防治及生物防治手段很難達到理想的防治效果。目前，基于天牛成蟲與寄主植物之間化學信息聯(lián)系的化學生態(tài)研究，已成為天牛防治新途徑的研究熱點。諸多研究表明，天牛的嗅覺在利用寄主植物釋放的揮發(fā)性次生物質識別寄主的過程中起非常關鍵的作用。本研究旨在通過轉錄組測序和RT-PCR技術確定青楊天牛主要的嗅覺相關蛋白基因及其表達譜情況，為基于嗅覺調控的環(huán)境友好型害蟲防治新技術的設計和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在吉林省白城市鎮(zhèn)賚縣采集到被青楊天牛危害的青楊樹枝，帶回室內并在養(yǎng)蟲籠中培養(yǎng)[溫度：（27±1） ℃，濕度：（75±5）%，光—暗周期16 h—8 h]直到成蟲羽化，并飼喂楊樹側枝和葉子。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成

在體式顯微鏡下，使用DEPC處理過的鑷子將羽化10 d左右的青楊天牛成蟲觸角剝離，共選取20頭成蟲，分別包括10頭雌蟲和10頭雄蟲。獲取的組織在使用前需在經(jīng)DEPC處理過的1 ∶1的水和乙醇溶液中在冰上保存?？俁NA的提取使用TRIzol溶液將觸角混勻，提取后，在乙醇/異丙醇沉淀中加入30 μL去RNA酶水。在提取結束后，整個RNA用Nano-Drop 2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在紫外吸收值 230 nm/260 nm和260 nm/280 nm下檢測RNA產(chǎn)物的純度，在28S rRNA條帶證實了RNA的完整性。在RT-PCR試驗中從5頭天牛個體中獲得RNA樣品。從雌性樣品中得到共2 000 ng的總RNA。因此，相同數(shù)量的總RNA被轉化成cDNA，通過20 μL體系，包括：4 μL的first-strand buffer（250 mmol/L Tris pH值8.3、375 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2），1 μL 10 mmol/L dNTP mix、1 μL RNaseout、1 μL DTT（0.1 mol/L）、1 μL oligo-（dT） 20 primer（50 μmol/L）和1 μL Superscript Ⅲ reverse transcriptase（200 units/μL）（Invitrogen，15 Carlsbad，CA，USA）。cDNA的合成在50 ℃下進行45 min后在70 ℃下進行15 min。

1.2.2 RNA測序、組裝和功能注釋

對于RNA測序，總RNA樣品用Qubit 2.0 （Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）和Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）進行測序。高質量的RNA被送到博瑞得科技公司（中國楊凌）用于cDNA的建庫和測序。mRNA的純化使用magnetic oligo（dT）beads（中國北京全式金）。RNA序列庫用AMPure XP bead kit的隨機接頭引物來進行Illumina 測序（Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA，USA）。觸角cDNA樣品使用AMPure XP beads（Beckman Coulter，Inc.）進行純化。短cDNA片段通過末端修復配適器進行擴增。合適長度的片段利用Agencourt AMPure XP beads（Beckman Coulter，Inc.）選擇并通過PCR進行擴增。測序通過Illumina HiSeqTM 2500進行。

1.2.3 青楊天牛嗅覺相關基因的鑒定

根據(jù)本研究轉錄組測序的結果，與已鑒定出的包括云斑天牛[8]、松褐天牛[9-10]和光肩星天牛[11]的嗅覺基因序列進行比對分析，對青楊天牛嗅覺基因進行命名。

1.2.4 青楊天牛嗅覺相關基因RT-PCR

收集不同組織時選取觸角20對、頭部（去除觸角）10個、胸部10個、腹部10個、足和翅各30對。選擇青楊天牛觸角具有全長閱讀框的同源基因，其中包括：22個OBP、9個CSP、9個OR、4個觸角IR（IR8a1、IR8a2、IR25a和IR76b）及它們的亞型進行RT-PCR分析。進行半定量RT-PCR的cDNA樣品制備同上。為進行表達定量和半定量RT-PCR試驗，從雌性天牛觸角和其他器官提取的1 μL DNA酶處理后的cDNA樣品作為模板，以β-Actin作為內參基因。

PCR反應條件如下：94 ℃預變性1 min 30 s;94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，32個循環(huán);最后68 ℃ 7 min。12 μL的擴增產(chǎn)物檢測采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。每個擴增產(chǎn)物至少進行3次重復，采用ImageJ 1.6（http：//rsb.info.nih.gov/ij/）進行分析。

2 結果與分析

2.1 青楊天牛觸角轉錄組生物信息學分析

2.1.1 轉錄組測序產(chǎn)量統(tǒng)計

由圖1可知，測序產(chǎn)生的clean堿基數(shù)為15.35 Gb。最終篩選得到 87 984 條unigene。所有87 984條unigene平均長度為471.41 bp，其中長度（1～2 kb）有5 612 unigene，長度（>2 kb）有2 492 unigenes，長度超過 1 kb 有8 104 unigene，其中36 147 unigene與已知蛋白基因匹配。

2.1.2 基因功能注釋

由圖2可知，GO分類結果，12 932個成功進行GO注釋的unigene可以分成3個類別：累積到生物學過程（biological process）不同亞類的26 942個次，細胞組分（cellular component）不同亞類的17 735個次，歸到分子功能（molecular function）不同亞類的15 944個次。在生物學過程類別中，metabolic process和cellular process基因數(shù)最高，分別為8 343個和6 174個;細胞組分類別中，cell part和cell是最高的2個亞類，分別是3 963個和 3 961個;而與觸角基因表達相關的catalytic activity和binding是分子功能類別中豐度最高的2個亞類，分別為7 203個和6 270個。

由圖3可知，青楊天牛觸角unigene按照同源基因數(shù)據(jù)聚類（COG，clusters of orthologous groups databases）功能注釋，可分為 25 個功能群。其中，注釋為一般功能預測類，復制、重組及修復類，翻譯與核糖體構建及合成生物源類的unigene個數(shù)最多，分別為3 051、1 349、1 279條;而注釋為核酸結構類、細胞外結構類、RNA加工和修飾類的unigene最少，分別為4、19、80條。

2.2 青楊天牛嗅覺相關基因的鑒定

由表1、表2可知，共鑒定出青楊天牛嗅覺基因包括：43個OBP、15個CSP、56個OR和24個IR。根據(jù)它們的長度、啟動子密碼子、終止密碼子和蛋白質結構，22個OBP、9個CSP、4個OR和2個IR具有全長的開放閱讀框。

2.3 青楊天牛嗅覺相關基因的表達

由圖4可知，RT-PCR試驗結果表明，雖然SpopOBP3、SpopOBP4、SpopOBP6、SpopOBP9、SpopOBP10、SpopOBP23、SpopOBP27、SpopOBP29、SpopOBP33和SpopOBP38在非嗅覺組織中表達，大量的嗅覺基因仍在觸角特異性的表達。其中，SpopIR76b、SpopOR24、SpopOBP3、SpopOBP4、SpopOBP6、SpopOBP16、SpopOBP17、SpopOBP19、SpopOBP23、SpopOBP24、SpopOBP33、SpopCSP3、SpopCSP4、SpopCSP5和SpopCSP7 在青楊天牛的觸角中高表達。

3 討論與結論

本研究共鑒定出青楊天牛嗅覺基因主要包括：43個氣味結合蛋白（OBP）、15個化學感受蛋白（CSP）、56個嗅覺受體（OR）和24個離子受體（IR）。這些基因存在性別特異性，后續(xù)應進一步深入研究。

與光肩星天牛的OR相比較[11]，由表2可知，青楊天牛的OR數(shù)量相對較低，說明大量青楊天牛的OR可能沒有被鑒定出來。然而，青楊天牛的OR數(shù)量明顯高于松褐天牛，說明本研究中的測序深度是足夠的。此外，本研究鑒定出43種青楊天牛的OBP，在光肩星天牛和松褐天牛分別鑒定出51種和52種[10-11]，為以后進一步的嗅覺相關基因進化分析提供了充足的數(shù)據(jù)。

大量的CSP在非嗅覺組織中，表明CSP的功能是探測二氧化碳、幼蟲的發(fā)育和足的再生[12]。SpopOBP24在雌性觸角中高表達，說明該基因與雌蟲的特異性行為有關，例如交配和產(chǎn)卵。Zhang等研究表明，在一些種類的天牛中存在接觸性性信息素（contact sex pheromone）[13]，因此SpopOBP24值得進一步深入研究。SpopOBP23、SpopCSP3和SpopCSP4在雄性觸角中高表達。Leal等發(fā)現(xiàn)一些種類的天牛存在雄性信息素，但青楊天牛的性信息素成分目前并不明確，有必要進一步對SpopOBP23、SpopCSP3和SpopCSP4的功能進行研究[14]。

截至目前，對鞘翅目昆蟲當中嗅覺感受蛋白的研究國內外僅報道30余個種[11-12，15]，天?？评ハx中報道了8個種[16-21]，僅光肩星天牛和赤擬谷盜等個別物種大部分嗅覺蛋白家族有系統(tǒng)報道，絕大多數(shù)的物種僅研究了1個或幾個蛋白家族甚至或僅報道了個別嗅覺基因序列。由于序列和物種的數(shù)量有限，不能對整個嗅覺蛋白家族進行進化分析，無法將OBPs等進一步劃分到各個亞型，鞘翅目作為昆蟲綱最大的一個目，未來有更多物種的嗅覺基因采用分子生物學手段進行鑒定，這有利于促進整個昆蟲綱嗅覺蛋白的進化研究。另外，通過RNA干涉技術或基因敲除等手段觀察昆蟲行為也是未來需要進一步拓展的方向。

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