巴戟天對(duì)人源結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116移植瘤的抑制作用及機(jī)制初步探討

李燦濤，盧穎裕，陳勇兒，梁 健1,，侯少貞1,，陳鑑強(qiáng)1,,

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東汕頭 515041；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053）

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，為世界第三大癌癥，嚴(yán)重威脅著人類生命健康[1?2]。中醫(yī)認(rèn)為，結(jié)腸癌的主要癥候之一為脾腎陽(yáng)虛。此外，不良飲食習(xí)慣和情緒的干擾，可導(dǎo)致胃腸受損，加速結(jié)腸癌病程的發(fā)展[3]。臨床上對(duì)于結(jié)腸癌的治療主要手段為根治性手術(shù)，并輔以放療、化療和中醫(yī)治療[4]。結(jié)直腸癌的化療藥物，如5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑，在對(duì)抗癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞造成一定程度的損傷，長(zhǎng)期化療可導(dǎo)致腹瀉、口腔黏膜炎，更甚者會(huì)造成嚴(yán)重的后遺癥，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[5]。基于結(jié)直腸癌的發(fā)病過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，尋找適合長(zhǎng)期服用并有抑制腫瘤生長(zhǎng)效果的藥物，具有較好的應(yīng)用前景。

中醫(yī)認(rèn)為結(jié)腸癌的病機(jī)主要為：腸道蘊(yùn)結(jié)濕熱、火毒為病之標(biāo)；腎虧、正氣不足為病之本。故治療結(jié)腸癌應(yīng)當(dāng)以清熱利濕和補(bǔ)腎為主[6?8]。巴戟天是我國(guó)“四大南藥”之一，屬于藥食同源、藥理活性明確的中藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，因此，具有良好的開(kāi)發(fā)前景[9]。關(guān)于巴戟天的抗腫瘤活性，最早的報(bào)道是來(lái)源于巴戟天醇提物抑制腫瘤形成的研究。該報(bào)道指出，巴戟天醇提物抑制腫瘤形成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶磷脂酰肌醇-3-活化醇素的活性，從而限制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。環(huán)烯醚萜苷類化合物作為巴戟天乙醇提取物的主要成分之一，其主要的單體成分包括具有抗腫瘤活性的水晶蘭苷、香茅苷和骨化三醇A，三者均對(duì)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白活化劑AP-1有明顯的抑制作用[11]。然而，巴戟天的抗腫瘤活性是否可通過(guò)其他途徑實(shí)現(xiàn)尚未有深入的探討。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天乙醇提取物對(duì)硫酸葡聚糖（Dextran sulfate，DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠具有顯著療效，通過(guò)下調(diào)腸道促炎因子的分泌，有效緩解腸道炎癥環(huán)境，改善小鼠腸道屏障受損[12]。眾所周知，腸道長(zhǎng)期處于炎性環(huán)境是誘發(fā)腸道癌變的重要因素[13]?；诖耍接懓完焓欠衲軌蜃鳛閷?duì)抗結(jié)直腸癌的潛在藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此，本研究擬建立人源結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞移植瘤模型，探討巴戟天是否具有抑制結(jié)直腸癌的作用，并初步探討其可能的潛在干預(yù)機(jī)制。本研究結(jié)果為后續(xù)對(duì)于巴戟天應(yīng)用結(jié)直腸炎、癌的預(yù)防應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SPF級(jí)裸鼠（6~8周）40只，18~22 g 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（粵）2019-0003；人源結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

巴戟天生藥（鹽制品） 購(gòu)于深圳Lush有限責(zé)任公司，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院丁平教授鑒定和提供；巴戟天乙醇提取物 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)侯少貞課題組制備得到；5-氟尿嘧啶（5-FU） 購(gòu)于廣州瑞舒生物有限公司，批號(hào)：20190301；DAB顯色試劑盒（20×） 購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：K192421C；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 購(gòu)于大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)：MA0082-3-APR-12D；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液 購(gòu)于博士德生物工程有限公司，批號(hào)：13K08A24；免疫組化試劑盒 購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AI07258834；Mouse PGE2測(cè)定試劑盒 購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：MM-0062M1；iNOS抗體 Affinity公司，批號(hào)：7913216；CD206抗體 R&D system公司，批號(hào)：WFT011801A；HIF-1α抗體 購(gòu)于Affinity公司，批號(hào)：17v4560；COX-2抗體 購(gòu)于SAB公司，批號(hào)：4813；VEGF抗體 購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：LS194929；GAPDH小鼠單克隆抗體 購(gòu)于Protein-tech公司，批號(hào)：10008047；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 購(gòu)于碧云天公司，批號(hào)：P0018S。

BSA224S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；500-151-30型電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺 日本Mitutoyo公司；HP300組織脫水機(jī)、HBM-1型組織包埋機(jī)、TM-4000組織切片機(jī)、DL6M型冷凍低速離心機(jī)、MR-96A型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、DW86型?80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Fisher公司；CU600型電熱恒溫水浴鍋 中國(guó)中新醫(yī)療儀器有限公司；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī) 中國(guó)常州金壇良友儀器有限公司；ZY-300型渦旋儀 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；HF-24M型全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀 上海賀帆儀器有限公司；CKX-41-32型倒置型顯微鏡、CM-24-11型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；Zeiss LSM800型激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)蔡司公司；SW-CJ-2F型雙人雙面型潔凈工作臺(tái) 南京曉曉儀器設(shè)備有限公司；MCO-20AIC型細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本Sanyo儀器有限公司；165-8033型蛋白電泳儀、170-3848型Trans-Blot半干轉(zhuǎn)印槽 美國(guó)Bio-rad公司；Tanon2500型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物制備 巴戟天生藥（鹽制品）經(jīng)干燥，超微粉碎獲得；巴戟天乙醇提取物制備方法：將制取的巴戟天粉末用8倍量85%乙醇加熱回流2 h，重復(fù)兩次，合并兩次提取液，回收溶劑，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得到的濃縮液在真空下冷凍干燥后得浸膏后低溫烘干打粉，并存放于4 ℃冰箱。經(jīng)檢測(cè)，巴戟天乙醇提取物中環(huán)烯醚萜的主要活性成分為水晶蘭苷，含量為2.12%[12]。

1.2.2 細(xì)胞準(zhǔn)備 將儲(chǔ)存于液氮罐的HCT-116細(xì)胞取出，在37 ℃恒溫水浴鍋中來(lái)回晃動(dòng)快速解凍。將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行離心（1000 r/min），棄上清液，加入含有9%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，吹打均勻，而后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）。細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后，加入胰酶消化液將細(xì)胞從瓶壁脫落，然后加入完全培養(yǎng)基終止消化。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為107個(gè)/mL，于每只裸鼠腋下接種0.2 mL細(xì)胞懸液，造實(shí)體瘤裸鼠模型。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 動(dòng)物造模和分組 動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別動(dòng)物房，飼養(yǎng)溫度為22~25 ℃，濕度：45%~55%，每日光照12 h，每天給予動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料自由食用和蒸餾水自由飲用。

40只裸鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，腋下接種0.2 mL細(xì)胞密度為107個(gè)/mL的HCT-116細(xì)胞懸液，造成實(shí)體瘤動(dòng)物模型。接種后24 h內(nèi)將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組。每天觀察裸鼠狀態(tài)并且記錄小鼠的體重和腫瘤體積。每天使用電子游標(biāo)卡尺量取小鼠腋下的腫瘤，以瘤體任意兩點(diǎn)連線最長(zhǎng)的長(zhǎng)度為長(zhǎng)徑（a）以及垂直于a的最大長(zhǎng)度為寬徑（b），計(jì)算和記錄腫瘤體積。腫瘤體積的計(jì)算公式：腫瘤體積=0.5×a×b2。裸鼠的造模流程可參見(jiàn)圖1。

圖1 HCT-116移植瘤小鼠造模Fig.1 Procedure of modeling HCT-116 xenograft tumor in mice

飼養(yǎng)一周后，剔除腫瘤增長(zhǎng)過(guò)快或未形成腫塊的動(dòng)物；待裸鼠皮下腫瘤體積達(dá)到200~300 mm3，將全部裸鼠按腫瘤體積隨機(jī)分組，分別為：對(duì)照組（Control group）、5-氟尿嘧啶組（5-FU group）（30 mg/kg，每3 d給藥1次，腹腔注射給藥），巴戟天乙醇提取物組（EEMO group，12 mg/kg/d，灌胃給藥）、巴戟天生藥組（CDMO group，200 mg/kg/d，灌胃給藥），每組共有10只裸鼠。每5 d觀察裸鼠狀態(tài)并且記錄小鼠的體重和腫瘤體積。對(duì)照組每天灌胃等體積蒸餾水和每3 d腹腔注射等體積蒸餾水，EEMO和CDMO組除每天灌胃相應(yīng)藥物外另每3 d腹腔注射等體積生理鹽水。所有裸鼠均給予自由飲食飲水。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第23 d結(jié)束，對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，剖取腫瘤組織進(jìn)行稱量、記錄重量和保存。

1.2.3.2 血液與腫瘤組織收集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)裸鼠進(jìn)行乙醚麻醉，眼眶取血。4 ℃條件下以3500 r/min離心血液15 min得血清，血清保存于?80 ℃冰箱中備用。隨后對(duì)小鼠進(jìn)行脫頸椎法處死，并小心剖去皮下腫瘤組織，測(cè)量腫瘤重量，并拍照記錄。取1/4腫瘤組織用于病理學(xué)檢測(cè)，1/4腫瘤組織用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，剩余部分凍存于?80 ℃冰箱中備用。

1.2.4 體外指標(biāo)檢測(cè)

1.2.4.1 病理學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，切取每個(gè)腫瘤的1/4浸泡于4 %甲醛。將浸泡4 %甲醛超過(guò)48 h的腫瘤組織，進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋等程序，切成4 μm薄片附載于粘附性載玻片上，將載玻片在60 ℃烘箱中烘烤2 h，隨后使用組織自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosin staining, HE）染色，具體染色操作參考WANG等[14]的方法。對(duì)染色完成后的載玻片進(jìn)行風(fēng)干，用中性樹(shù)脂和蓋玻片進(jìn)行封片操作，置于電子顯微鏡下觀察和拍攝（200×和400×）。

1.2.4.2 Western blotting法檢測(cè)VEGF、HIF-1α和COX-2的水平 剪取0.1 g腫瘤組織加入到含有預(yù)冷的混合裂解液（RIPA:PMSF=100:1）的EP管中，使用研磨儀進(jìn)行組織勻漿，靜置30 min。將勻漿液進(jìn)行離心（12000 r/min，15 min），取上清，按BCA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取每組等蛋白量的樣品進(jìn)行電泳和封閉后，加入VEGF、HIF-1α和COX-2一抗（1:1000），4 ℃孵育過(guò)夜。次日，回收一抗，用含0.5 %TBST的磷酸鹽緩沖液洗滌后，分別加入二抗（1:3000），室溫孵育2 h?；厥斩共⑾礈旌螅褂肊CL試劑盒在發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影成像，對(duì)條帶進(jìn)行拍攝記錄。具體操作參考WANG等[14]的方法。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。后續(xù)使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.4.3 VEGF、HIF-1α和COX-2的免疫組化檢測(cè)

將附載腫瘤組織的載玻片放置烘箱內(nèi)60 ℃烘烤2 h后進(jìn)行脫蠟，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)和3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶。按免疫組化試劑盒說(shuō)明書要求對(duì)組織進(jìn)行封閉，后孵育一抗VEGF、HIF-1α和COX-2（1:200），4 ℃孵育過(guò)夜。次日孵育相應(yīng)的二抗以及辣根素酶試劑。DAB顯色液避光顯色，蘇木素復(fù)染，再進(jìn)行乙醇梯度濃度脫水，使用中性樹(shù)膠和蓋玻片進(jìn)行封片。將載玻片置于電子顯微鏡下觀察拍攝。具體操作參考ZONG等[15]的方法。使用Image J軟件對(duì)相關(guān)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行分析。

1.2.4.4 巨噬細(xì)胞分型的免疫熒光法檢測(cè) 將附載腫瘤組織的載玻片放置于烘箱內(nèi)60 ℃烘烤2 h后，進(jìn)行脫蠟和脫水操作，再使用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)和3%過(guò)氧化氫室溫孵育30 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶。室溫封閉1 h后，滴加一抗iNOS和CD206（1:200），4 ℃孵育過(guò)夜。次日滴加相應(yīng)的二抗，避光孵育2 h。洗滌后滴加DAPI對(duì)細(xì)胞核染色，室溫孵育3 min。避光條件下滴加抗熒光猝滅劑覆蓋蓋玻片，將樣品置于激光共聚焦顯微鏡下觀察和拍攝。具體操作參考ZONG等[15]的方法。使用ZEM軟件對(duì)組織上相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Graph Pad Prism 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作圖。組間差異比較采用單因素方差分析，當(dāng)組間兩兩比較，方差齊則采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用DunnettT檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴戟天對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)于第23 d結(jié)束，實(shí)驗(yàn)期間通過(guò)記錄小鼠體重以及腫瘤體積的變化，反映小鼠狀態(tài)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剖取小鼠體內(nèi)腫瘤進(jìn)行稱量和拍照記錄，可直觀反映腫瘤的生長(zhǎng)狀況。與實(shí)驗(yàn)第1 d各組小鼠的平均體重相比，各組小鼠第23 d的平均體重均發(fā)生下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05；圖2A所示）。此外，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組動(dòng)物平均腫瘤體積逐步增加。與對(duì)照組相比，5-FU組、EEMO組和CDMO組的腫瘤體積生長(zhǎng)速度減緩（P<0.05；圖2B所示）。剖取動(dòng)物皮下的腫瘤，直觀可見(jiàn)對(duì)照組腫瘤體積最大，各給藥的腫瘤大小比對(duì)照組??；與對(duì)照組相比，5-FU（P<0.05）、EEMO（P<0.01）和CDMO（P<0.01）均能顯著降低腫瘤重量；與5-FU組相比，EEMO和CDMO均能使腫瘤質(zhì)量下降，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2C和圖2D所示）。結(jié)果表明，EEMO和CDMO能干預(yù)小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)進(jìn)程，降低腫瘤的生長(zhǎng)速度，同時(shí)兩者對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用與5-FU相當(dāng)。

圖2 巴戟天對(duì)裸鼠HCT-116移植瘤的抑制情況Fig.2 Inhibitive effect of MO on HCT-116 xenograft tumor in mice

2.2 巴戟天對(duì)小鼠移植瘤病理學(xué)的影響

對(duì)移植瘤進(jìn)行病理分析，觀察EEMO和CDMO對(duì)腫瘤造成的病理學(xué)改變，可為進(jìn)一步深入研究提供方向。從腫瘤病理結(jié)果可得，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，腫瘤細(xì)胞致密，腫瘤邊緣有較多血管生成（黑色箭頭所示）。與對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥5-FU組、EEMO組和CDMO組動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞較致密，但出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域，伴有輕微血管生成增加，且出現(xiàn)核碎裂（圖3所示）。綜合各組的病理學(xué)結(jié)果，可表明5-FU、EEMO和CDMO可能通過(guò)抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)程，發(fā)揮抗腫瘤的作用。

圖3 巴戟天對(duì)HCT-116移植瘤病理學(xué)的影響Fig.3 Effects of MO on pathological changes on HCT-116 xenograft tumor

2.3 巴戟天對(duì)小鼠移植瘤中VEGF的影響

VEGF是一種高度特異性的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及血管的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[16]。由檢測(cè)結(jié)果可得，與對(duì)照組相比，5-FU（P<0.05）、EEMO（P<0.01）和CDMO（P<0.01）均能降低腫瘤VEGF表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A和圖4B所示）。同時(shí)，免疫組化的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5-FU（P<0.01）、EEMO（P<0.01）和CDMO（P<0.01）均能極顯著下調(diào)腫瘤中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)（圖4C和圖4D所示）。此外，與5-FU組相比，EEMO組和CDMO組的VEGF表達(dá)均有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4C和圖4D所示）。綜合VEGF的檢測(cè)結(jié)果，說(shuō)明巴戟天可通過(guò)下調(diào)腫瘤VEGF的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用；該結(jié)果與病理組織檢測(cè)結(jié)果相一致。

圖4 巴戟天對(duì)HCT-116移植瘤組織VEGF表達(dá)的影響Fig.4 The effects of MO on the expression of VEGF in HCT-116 xenograft tumor

2.4 巴戟天對(duì)腫瘤組織巨噬細(xì)胞極化的影響

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是浸潤(rùn)腫瘤組織的主要細(xì)胞群，其不同的分型（M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)）對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程有不同的作用[17]。其中，當(dāng)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分型趨向M1型巨噬細(xì)胞，表現(xiàn)為腫瘤殺傷和腫瘤血管抑制的作用；當(dāng)巨噬細(xì)胞分型趨向M2型巨噬細(xì)胞，表現(xiàn)為腫瘤血管增生，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用[18]。免疫熒光的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5-FU組、EEMO組和CDMO組腫瘤的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206表達(dá)水平有所下降，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖5B所示）。與對(duì)照相比，5-FU組（P<0.01）、EEMO組（P<0.01）和CDMO組（P<0.01）移植瘤組織的M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS表達(dá)水平極顯著上調(diào)（圖5C所示）。將同一樣本的iNOS熒光強(qiáng)度與CD206熒光強(qiáng)度作比值，統(tǒng)計(jì)分析可得5-FU組（P<0.01）、EEMO組（P<0.01）和CDMO組（P<0.01）的iNOS/CD206值與對(duì)照組相比極顯著升高（圖5D所示）。其中，與5-FU組相比，EEMO和CDMO均能提升iNOS/CD206值，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由此可得，經(jīng)EEMO和CDMO藥物干預(yù)后，M1型巨噬細(xì)胞的分化比例升高，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化趨勢(shì)偏向于M1型巨噬細(xì)胞，從而能夠解釋腫瘤血管生成減少。

圖5 巴戟天對(duì)HCT-116移植瘤巨噬細(xì)胞極化的影響Fig.5 The suppression of MO on macrophages polarization in HCT-116 xenograft tumor

2.5 巴戟天對(duì)腫瘤組織HIF-1α和COX-2的表達(dá)影響

HIF-1α作為腫瘤微環(huán)境中的重要調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)腫瘤對(duì)腫瘤微環(huán)境的適應(yīng)[19]。COX-2作為HIF-1α調(diào)節(jié)的下游轉(zhuǎn)錄因子，可提高PGE2的表達(dá)，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生發(fā)展和腫瘤血管的生成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有促進(jìn)的作用[20]。免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，5-FU組（P<0.01）、EEMO組（P<0.05）和CDMO組（P<0.05）的HIF-1α表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A和圖6C所示）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，5-FU（P<0.01）、EEMO（P<0.01）和CDMO（P<0.01）均能極顯著下調(diào)腫瘤COX-2的陽(yáng)性表達(dá)（圖6B和圖6D所示）。結(jié)果說(shuō)明EEMO和CDMO對(duì)腫瘤血管生成的影響可能與調(diào)節(jié)HIF-1α和COX-2的表達(dá)有關(guān)。

圖6 巴戟天對(duì)HCT-116移植瘤HIF-1α和COX-2表達(dá)的影響Fig.6 The suppression of MO on expression of HIF-1α and COX-2 in HCT-116 xenograft tumor

2.6 巴戟天對(duì)腫瘤組織HIF-1α和COX-2/PGE2信號(hào)通路的影響

COX-2/PGE2是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路。在腫瘤微環(huán)境中，COX-2/PGE2通路可刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤血管的生成，從而加快腫瘤形成的進(jìn)程[21]。對(duì)HIF-1α和COX-2/PGE2信號(hào)通路的表達(dá)做進(jìn)一步做定量分析。從結(jié)果分析可得，與對(duì)照組相比，5-FU組（P<0.01）、EEMO（P<0.01）組和CDMO組（P<0.01）的HIF-1α和COX-2的蛋白表達(dá)量極顯著下降（圖7B和圖7C所示）。此外，與對(duì)照組相比，5-FU組（P<0.01）、EEMO組（P<0.01）和CDMO（P<0.05）組腫瘤PGE2含量均下調(diào)（P<0.05）（圖7D所示），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明巴戟天可能是通過(guò)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)下游關(guān)鍵影響因子COX-2的表達(dá)，減少PGE2的分泌，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管生成的作用。

圖7 巴戟天對(duì)HCT-116移植瘤小鼠HIF-1α和COX-2/PGE2信號(hào)通路的影響Fig.7 Effects of MO on the expression of HIF-1α and COX-2/PGE2 signal pathways in HCT-116 xenograft tumor

3 討論

結(jié)腸癌作為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其腫瘤細(xì)胞的異常增殖和生長(zhǎng)會(huì)造成瘤體缺氧的現(xiàn)象，促使腫瘤細(xì)胞繼續(xù)增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[22]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）作為細(xì)胞缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)下游多種靶點(diǎn)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)腫瘤缺氧微環(huán)境，影響腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展[23?24]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，巴戟天生藥及其醇提物可致腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域增加，伴有輕微血管生成增加，且腫瘤血管生成的相關(guān)蛋白VEGF表達(dá)在藥物干預(yù)后出現(xiàn)明顯下降，提示巴戟天生藥及其醇提物能夠抑制腫瘤血管新生，推測(cè)其可能具有抑制HIF-1α活性的作用。

已有研究證明，HIF-1α在多種惡性腫瘤中通過(guò)調(diào)控COX-2的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)COX-2生成[25?26]。COX-2參與腫瘤的惡性進(jìn)程主要與催化花生四烯酸生成PGE2相關(guān)[27]。作為COX-2的關(guān)鍵催化產(chǎn)物，PGE2是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的促炎介質(zhì)[28?29]。HIF-1α和COX-2/PGE2信號(hào)通路的活化可抑制機(jī)體腫瘤免疫，加速腫瘤的惡性進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19?20]。目前，越來(lái)越多的研究結(jié)果證實(shí)HIF-1α和COX-2/PGE2可以干預(yù)腫瘤微環(huán)境血管新生和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫抑制性[30?32]。在本研究中，巴戟天生藥及其醇提物可明顯抑制HIF-1α和COX-2/PGE2信號(hào)通路在腫瘤組織的陽(yáng)性表達(dá)，且在蛋白水平方面也明顯受到抑制，提示巴戟天生藥及其醇提物可通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞的HIF-1α表達(dá)，從而調(diào)控下游COX-2/PGE2信號(hào)通路的低表達(dá)，發(fā)揮對(duì)抗腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

腫瘤的形成與發(fā)展受多種因素的調(diào)控。巨噬細(xì)胞在腫瘤免疫抑制過(guò)程中充當(dāng)重要的角色，并且通過(guò)不同的極化狀態(tài)影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17?18]。巨噬細(xì)胞的極化分為經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞（即M1型巨噬細(xì)胞）和替代激活的巨噬細(xì)胞（即M2型巨噬細(xì)胞）。M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞分別具有腫瘤殺傷性和免疫抑制性，而在腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞主要呈現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的特征，即表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤血管的增生[33?34]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。在本研究中，巴戟天生藥及其醇提物能夠誘導(dǎo)腫瘤組織中M1型巨噬細(xì)胞的比例升高。這說(shuō)明巴戟天還可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮抑癌作用。除此之外，對(duì)比巴戟天生藥和巴戟天乙醇提取物兩者的藥效作用，盡管巴戟天乙醇提取物對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展干預(yù)作用比巴戟天生藥藥效略優(yōu)，但二者之間的差距并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。導(dǎo)致這種情況的發(fā)生可能是由于巴戟天乙醇提取物中的抗腫瘤成分與巴戟天生藥相比更加集中。對(duì)于巴戟天生藥和巴戟天乙醇提取物的比較需要更深入的實(shí)驗(yàn)分析進(jìn)行研究。同時(shí)，巴戟天作為藥食同源類中藥材，其保健功效已經(jīng)得到初步的開(kāi)發(fā)和探索，龍碧波[35]研究發(fā)現(xiàn)巴戟天可明顯改善負(fù)重游泳小鼠的疲勞指標(biāo)，發(fā)揮抗疲勞作用；周月[36]發(fā)現(xiàn)巴戟天提取物聯(lián)合γ-氨基丁酸和茶氨酸對(duì)抑郁患者精神軀體癥狀和睡眠質(zhì)量有積極的療效；石小瓊[37]團(tuán)隊(duì)研究開(kāi)發(fā)巴戟天為日常保健品和食品，如巴戟天口服液、巴戟天果脯和巴戟天果酒等。綜上所述，開(kāi)發(fā)巴戟天成為保健品食品依然具有非常大的潛力和市場(chǎng)。

綜上，巴戟天可能通過(guò)抑制HIF-1α和COX-2/PGE2信號(hào)通路的活化，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮抑制腫瘤血管新生的作用，從而影響結(jié)直腸癌移植瘤的發(fā)生和發(fā)展。