黃雅婷,阮征,李丹丹,李汴生*,錢江
(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640)(2.珠海世通超高壓技術(shù)應(yīng)用研究院有限公司,廣東 珠海 519180)
超高壓非熱殺菌技術(shù)(High-Pressure Processing)能在常溫或低溫下有效滅活食品中的微生物和酶,且不會產(chǎn)生共價鍵的斷裂,使加工食品的化學(xué)變化很小,因此,與傳統(tǒng)的熱殺菌處理相比,超高壓非熱殺菌技術(shù)具有保持食品原有的感官特性和營養(yǎng)成分的特點[1,2]。有研究表明,超高壓處理貝類如牡蠣[3,4]、蛤蜊[5]時,能在保證殺菌效果的同時對感官評價、質(zhì)構(gòu)、色差等無明顯影響。袁超[6]利用電子舌對比研究超高壓處理和熱處理對牡蠣滋味的影響,發(fā)現(xiàn)超高壓處理后滋味分布與生鮮牡蠣接近,而熱處理的滋味分布較遠(yuǎn),說明超高壓處理與熱處理相比,能更好的保持牡蠣原本的生鮮滋味。目前超高壓在水產(chǎn)品發(fā)酵方面的研究主要集中在水產(chǎn)品發(fā)酵后的殺菌方面,將超高壓用于水產(chǎn)品發(fā)酵預(yù)處理的研究較少。
隨著市場對風(fēng)味的多元化的需求增大,有關(guān)貝類發(fā)酵產(chǎn)品的研究逐漸增加。施雯[7]以近江牡蠣(Crossostrea rivularis)為原料,經(jīng)蛋白酶水解、脫腥處理后使用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌發(fā)酵,得到了營養(yǎng)豐富、風(fēng)味較好的牡蠣乳酸菌飲料。魏巍[8]以海灣扇貝為主要原料,加入豆粕和大米后用米曲霉發(fā)酵制作扇貝醬,得到了品質(zhì)較高,具有醬香味和濃郁的海鮮風(fēng)味的扇貝醬。
在發(fā)酵的過程中除了生成脂肪酸、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)外,還可能會產(chǎn)生生物胺等不良代謝產(chǎn)物,大劑量的生物胺具有一定的毒性,攝入過量的生物胺會導(dǎo)致腎上腺素和胃酸分泌過多,血糖水平升高,并引起諸如頭痛和惡心的過敏反應(yīng)[9]。通過微生物產(chǎn)氨基酸脫羧酶催化氨基酸脫羧生成生物胺,是發(fā)酵水產(chǎn)品中的生物胺的主要產(chǎn)生方式[10],需要有作為前體物質(zhì)的游離氨基酸,產(chǎn)氨基酸脫羧酶活性的微生物和適宜的環(huán)境與條件。水產(chǎn)品及其制品,以魚類制品為代表,被認(rèn)為是最容易累積生物胺的一類食品,其中以海產(chǎn)鯖科魚類如鯖魚、金槍魚等含量尤為高[11]。腐胺(1,4-Diaminobutane)和尸胺(1,5-pentanediamine),是貝類貯藏過程中含量增長較高的兩種生物胺,齊鳳生等[12]研究發(fā)現(xiàn)4 ℃貯藏的海灣扇貝在10 d腐胺、尸胺含量分別為47.43、81.63 mg/kg;Mackie I M等[13]研究發(fā)現(xiàn)10 ℃貯藏的扇貝內(nèi)收肌在6 d腐胺、尸胺含量為49.3、19.1 mg/100 g;趙中輝[14]研究發(fā)現(xiàn)雜色蛤在 20 ℃貯藏 2 d腐胺、尸胺含量為 237.83、57.14 mg/kg。
戊糖片球菌(Pediococcus pentosus)是乳酸菌的一種,廣泛分布于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中,可用于肉類發(fā)酵,具有蛋白酶和脂肪酶活性[15],能使pH值迅速下降,從而抑制假單胞菌、微球菌和腸桿菌科等細(xì)菌的生長[16],并產(chǎn)生風(fēng)味化合物,使發(fā)酵肉制品產(chǎn)生特征風(fēng)味[17],據(jù)報道,片球菌屬無氨基酸脫羧酶活性,不具有產(chǎn)生物胺的能力[18]。本文對比研究超高壓殺菌預(yù)處理、熱殺菌預(yù)處理和無殺菌預(yù)處理,對雜色蛤(Ruditapes philippinarum)經(jīng)過初步酶解后使用戊糖片球菌發(fā)酵制成的雜色蛤發(fā)酵醬,評價其發(fā)酵效果、感官評價以及腐胺、尸胺含量的影響。
雜色蛤,長3.98±0.26 cm,購于市場;戊糖片球菌,GIM編號:1.925,廣東省微生物菌種保藏中心;MRS肉湯,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;平板計數(shù)瓊脂,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;木瓜蛋白酶100000 u/g,南寧龐博生物有限公司;風(fēng)味蛋白酶50000 u/g,百盛生物科技有限公司;尸胺鹽酸鹽、腐胺鹽酸鹽,源葉生物科技有限公司;乙腈(高效液相色譜專用),四友精細(xì)化學(xué)品有限公司;丹酰氯,上海麥克林生化科技有限公司;鹽酸、三氯乙酸、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、丙酮、濃氨水,廣州化學(xué)試劑廠。
UUPF/5L/800 MPa超高壓設(shè)備,內(nèi)蒙古包頭科發(fā)新型高技術(shù)食品機(jī)械有限責(zé)任公司;TS48S真空封口機(jī),兄弟科技股份有限公司;TDL-40B離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海申賢恒溫設(shè)備廠;BHS-2顯數(shù)恒溫水浴鍋,江陰市保利科研機(jī)械有限公司;PHs-3C pH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;CR-400便攜式色差儀,日本柯尼卡美能達(dá)公司;TA-XT2物性測試儀,英國Stable Micro System公司;SKD-1000全自動凱氏定氮儀,上海沛歐分析儀器有限公司;C18色譜柱,waters沃特世科技有限公司;1260-高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司。
超高壓處理:將洗凈后的雜色蛤裝入聚乙烯袋中,每袋5個,真空密封,進(jìn)行超高壓處理,處理壓力為400 MPa,保壓時間為6 min,溫度為25 ℃;熱處理:100 ℃水煮加熱 6 min;對照組:使用脫殼刀對洗凈后的雜色蛤進(jìn)行手工脫殼。
1.4.1 戊糖片球菌懸菌液的制備
將戊糖片球菌培養(yǎng)液接種至MRS液體培養(yǎng)基中,于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h,將培養(yǎng)液在 3000 r/min下離心10 min,倒掉上清液并收集菌體重懸在0.85%的無菌生理鹽水中,用平板計數(shù)法測出懸菌液的菌體濃度,并稀釋至約8 lg CFU/mL。
1.4.2 酶解和發(fā)酵處理
在無菌環(huán)境下,將預(yù)處理后的雜色蛤的肉和汁液于絞肉機(jī)中攪碎3 min,在漿液中加入6%(m:m)的食鹽、3000 U/g的木瓜蛋白酶和1000 U/g的風(fēng)味蛋白酶,搖勻后置于45 ℃的水浴鍋中恒溫酶解1.5 h,再加入6%的懸菌液,于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中密封發(fā)酵36 h。
1.5.1 菌落總數(shù)的測定
參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》進(jìn)行測定。
1.5.2 水分含量的測定
取經(jīng)過預(yù)處理的雜色蛤肉,參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》中的直接干燥法進(jìn)行測定,樣品測定3次取平均值。
1.5.3 pH值的測定
參照GB 5009.237-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測定》進(jìn)行測定,樣品測定3次取平均值。
1.5.4 氨基酸態(tài)氮的測定
參照GB 5009.235-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的酸度計法進(jìn)行測定,樣品測定3次取平均值。
1.5.5 總酸的測定
參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》中的pH電位法進(jìn)行測定,樣品測定3次取平均值。
1.5.6 揮發(fā)性鹽基氮
參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的自動凱氏定氮儀法進(jìn)行測定,樣品測定3次取平均值。
1.5.7 腐胺和尸胺的測定:
參照Qiao等[19]和GB 5009.208-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測定》的方法略作修改。
生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取生物胺標(biāo)準(zhǔn)品適量,用0.1 mol/L鹽酸配制成濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、150.0 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。
樣品的提取:取5 mL發(fā)酵液置于50 mL離心管,加入20 mL 5%三氯乙酸溶液,渦旋混勻1 min,超聲處理40 min,3600 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液至50 mL容量瓶中,殘渣再提取一次,合并上清液并用5%三氯乙酸定容。
衍生:取1 mL待衍生的溶液置于10 mL容量瓶中,依次加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL 1 mol/L氫氧化鈉溶液(標(biāo)準(zhǔn)溶液不需要加入)、1 mL丹磺酰氯溶液,渦旋1 min后避光40 ℃水浴40 min,加入200 μL 25%濃氨水,避光靜置30 min,60 ℃水浴除丙酮,用乙腈定容,經(jīng)0.45 μm針頭濾器過濾,待測定。
色譜條件:C18色譜柱(柱長250 mm,柱內(nèi)徑4.6 mm,柱填料粒徑5 μm),紫外檢測波長254 nm,進(jìn)樣量40 μL,柱溫40 ℃,流動相A為純水,流動相B為純乙腈,流動相A:B=30:70,流速1.0 mL/min。
測得腐胺標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為y=0.0311x-0.1284,R2=0.9994;尸胺標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為y=0.0355x-0.1597,R2=0.9997。
1.5.8 感官評價
挑選10名經(jīng)過培訓(xùn)的人員組成感官評價小組,根據(jù)感官評價標(biāo)準(zhǔn)表對雜色蛤發(fā)酵醬的香味、鮮味、腥味、酸味、組織狀態(tài)進(jìn)行感官分析,感官評價總分為各項感官評價項目的和,采用雷達(dá)圖法對評分結(jié)果進(jìn)行分析與評價,感官評價標(biāo)準(zhǔn)表見表1。
表1 雜色蛤發(fā)酵醬感官評價評分表Table 1 Rating scale for sensory evaluation of fermented Ruditapes philippinarum sauce
使用Excel 2016、SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及顯著性差異分析(p<0.05),實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,采用Origin 2018進(jìn)行繪圖。
對經(jīng)過預(yù)處理的雜色蛤肉進(jìn)行菌落總數(shù)的測定,對照組的菌落總數(shù)為4.54 lg CFU/g,超高壓條件為400 MPa,6 min時和熱處理條件為100 ℃水浴8 min時菌落總數(shù)均未檢出。實驗結(jié)果表明超高壓條件為 400 MPa,6 min時可以使雜色蛤的菌落總數(shù)從 4.54 lg CFU/g降至檢出限下(<1.0 log CFU/g),具有良好的殺菌效果。
對經(jīng)過預(yù)處理的雜色蛤肉進(jìn)行水分含量的測定,對照組為84.34 g/100 g,超高壓預(yù)處理組為85.21 g/100 g,水分含量稍微上升(p>0.05),這是因為超高壓處理增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的水合作用[20];熱預(yù)處理組為 75.98 g/100 g,水分含量顯著減少(p<0.05),這是由于熱處理引起的水分子活動加強(qiáng)、肉的持水力降低、蛋白質(zhì)收縮等現(xiàn)象導(dǎo)致了肉的汁液流失[21]。
戊糖片球菌能夠?qū)κ吃葱灾虏【纳L起到明顯的抑制作用,因為戊糖片球菌能夠分泌具有廣譜抑菌作用的細(xì)菌素,分泌的有機(jī)酸降低pH值抑制致病菌的代謝,并通過競爭作用抑制致病菌黏附,通過與致病菌凝集抑制其發(fā)揮致病作用,從而達(dá)到抑制食源性致病菌的作用[22,23]。從圖1和圖2看出,隨著發(fā)酵時間的增加,對照組,超高壓組和熱處理組的雜色蛤發(fā)酵醬的總酸含量逐漸升高,pH值逐漸降低。超高壓組總酸的增加速度相比對照組的較為緩慢,熱處理組總酸的增加速度最為緩慢,在36 h時,超高壓組和熱處理組的總酸含量分別為1.80、1.71 g/100 mL,對照組為1.94 g/100 mL。在發(fā)酵的初始階段,pH的快速下降可確保發(fā)酵的安全[24],經(jīng)過三種預(yù)處理方法處理的雜色蛤發(fā)酵醬的pH值變化趨勢相似,在0~18 h下降迅速,18~36 h時下降緩慢,其中對照組的pH值下降最快,36 h時對照組、超高壓組、熱處理組的pH值分別為4.07、4.18、4.18。
氨基酸態(tài)氮含量是衡量雜色蛤發(fā)酵質(zhì)量和發(fā)酵程度的重要指標(biāo),在蛋白酶系的作用下,雜色蛤原料的蛋白質(zhì)被水解從而產(chǎn)生游離氨基酸,使得雜色蛤發(fā)酵醬中的氨基酸態(tài)氮含量增加。游離氨基酸作為重要的呈味物質(zhì),對雜色蛤發(fā)酵醬的風(fēng)味起到很大作用。而氨基酸態(tài)氮會在雜色蛤發(fā)酵后期參與美拉德反應(yīng)使顏色發(fā)生變化,以及參與的酯化反應(yīng)改變雜色蛤發(fā)酵醬的風(fēng)味[8]。
在初步酶解前,經(jīng)過預(yù)處理的對照組、超高壓組和熱處理組的雜色蛤勻漿的氨基酸態(tài)氮含量分布為0.32、0.30、0.22 g/100 mL,熱處理組的氨基酸態(tài)氮含量低于對照組和超高壓組,可能是熱處理過程中汁液流失導(dǎo)致的,王曉謙[25]研究發(fā)現(xiàn)熱處理使牡蠣的各種氨基酸含量有不同程度的減少,而超高壓處理從總體來看對水解氨基酸影響不顯著。經(jīng)過初步酶解,對照組、超高壓組和熱處理組的氨基酸態(tài)氮含量分別增加至0.39、0.36、0.27 g/100 mL。
從圖3看出,隨著發(fā)酵時間的增加,經(jīng)過三種預(yù)處理方法處理的雜色蛤發(fā)酵醬的氨基酸態(tài)氮含量都呈上升趨勢,其中對照組和超高壓組的氨基酸態(tài)氮含量的增加速度比熱處理組快,在 21 h前增加迅速,在21~36 h增加放緩。36 h對照組的氨基酸態(tài)氮含量增加到0.68 g/100 mL,超高壓組增加到0.68 g/100 mL,而SC/T 3602-2016中蝦醬氨基酸態(tài)氮含量≥0.60 g/100 g的標(biāo)準(zhǔn),SB/T 10324-1999中二級魚露氨基酸態(tài)氮含量≥0.65 g/100 mL的標(biāo)準(zhǔn)。
由于熱處理使原料雜色蛤出現(xiàn)了水分下降、蛋白質(zhì)收縮等現(xiàn)象,雜色蛤原料在攪碎后其漿液相比對照組和超高壓組的漿液分層明顯,導(dǎo)致熱處理組的發(fā)酵程度較低,發(fā)酵效果較差,氨基酸態(tài)氮含量增加緩慢,36 h熱處理組的氨基酸態(tài)氮含量增加到0.42 g/100 mL。
從圖4看出,隨著發(fā)酵時間的增加,經(jīng)過三種預(yù)處理方法處理的雜色蛤發(fā)酵醬的揮發(fā)性鹽基氮含量都呈上升趨勢,對照組和超高壓組在18~36 h時增加變緩,熱處理組在24~36 h時增加變緩。其中對照組的增加最迅速,36 h時揮發(fā)性鹽基氮含量為79.43 g/100 mL,熱處理組的增加最慢,為43.73 g/100 mL,超高壓組為65.15 g/100 mL。超高壓組的揮發(fā)性鹽基氮含量比熱處理組高,可能是因為超高壓處理的預(yù)處理殺菌效果沒有熱處理徹底,不同的微生物、菌株以及生長周期的不同階段,其耐壓性存在差異,例如革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌具有更強(qiáng)的抗壓能力,細(xì)菌孢子(梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌和脂環(huán)芽孢桿菌)和子囊孢子非常耐高壓,需要通過壓力(400~600 MPa)和溫度(90~120 ℃)的聯(lián)合處理(即壓力輔助熱處理,PATP)進(jìn)行滅活[26]。
食品中的生物胺,大多是由氨基酸在微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用下脫去羧基而成的[27]。由于水產(chǎn)品富含易被降解的蛋白質(zhì),且適宜微生物生長繁殖,所以水產(chǎn)品例如魚類,容易產(chǎn)生生物胺導(dǎo)致中毒[28]。從表2可以看出,對照組的腐胺含量在0~6 h時快速增加,在36 h時含量為0.64 mg/L,而經(jīng)過超高壓預(yù)處理和熱預(yù)處理的發(fā)酵醬在發(fā)酵過程中的腐胺含量均低于檢測下限。隨著發(fā)酵時間的增加,對照組的尸胺含量逐漸增加,在0~6 h時增加速度最快,在36 h時含量達(dá)到140.96 mg/L,而經(jīng)過超高壓預(yù)處理和熱預(yù)處理的發(fā)酵醬在0~24 h時尸胺含量低于檢測下限,24 h后稍微增加,36 h時分別為0.83和0.79 mg/L。從源頭上來看,微生物的污染是發(fā)酵水產(chǎn)品中生物胺產(chǎn)生的主要影響因素之一,因為預(yù)殺菌處理可有效降低原料中的微生物含量,且戊糖片球菌無氨基酸脫羧酶活性,無產(chǎn)生物胺的能力,所以預(yù)殺菌處理可以降低發(fā)酵過程中腐胺和尸胺的含量;而對照組由于原料中微生物含量較高,氨基酸在微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用下脫去羧基產(chǎn)生生物胺,所以腐胺和尸胺的含量較高。
表2 預(yù)處理方法對雜色蛤發(fā)酵過程中腐胺和尸胺含量的影響Table 2 Effect of pretreatment methods on putrescine and cadaverine contents in fermentation process of Ruditapes philippinarum
從圖5可以看出,在鮮味和組織狀態(tài)上,超高壓組與對照組接近,顯著高于熱處理組(p<0.05),這是由于經(jīng)過熱預(yù)處理的雜色蛤原料發(fā)生蛋白質(zhì)變性,產(chǎn)生脫水現(xiàn)象,所以發(fā)酵醬組織狀態(tài)分層明顯,并且熱處理后失去了雜色蛤原有的鮮味,產(chǎn)生了熟制的味道,而超高壓組和對照組的組織狀態(tài)較為均勻,并保留了海鮮的鮮味,保證雜色蛤發(fā)酵醬的特殊風(fēng)味不變;在腥味上,超高壓組和熱處理組接近,顯著高于對照組(p<0.05),說明超高壓預(yù)處理可以有效降低腥味;從香味和酸味上,熱處理組最高,其次超高壓組,對照組最低,超高壓預(yù)處理可有效降低發(fā)酵醬酸味,熱處理組的酸味最適中,對照組則酸味過重,熱處理組的蛤蜊醬包含了發(fā)酵香味和蛤蜊的熟制香味,所以香味的評分最高。經(jīng)感官評價,對照組、超高壓組和熱處理組的雜色蛤發(fā)酵醬的感官評價總分分別為 13.20、18.20和15.60,超高壓組的感官評價總分最高,其次是熱處理組,對照組的感官評價總分最低。
超高壓預(yù)處理和熱預(yù)處理均可以降低雜色蛤發(fā)酵醬發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性鹽基氮、腐胺和尸胺的含量,提高發(fā)酵的安全性,但超高壓預(yù)處理對雜色蛤發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量無明顯的影響,并能提高雜色蛤發(fā)酵醬的感官評價,保證雜色蛤發(fā)酵醬的特殊風(fēng)味不變,而熱預(yù)處理會降低雜色蛤發(fā)酵醬的鮮味和組織狀態(tài)評分,使氨基酸態(tài)氮的增加減緩。本論文對比研究超高壓殺菌預(yù)處理、熱殺菌預(yù)處理和無殺菌預(yù)處理對發(fā)酵雜色蛤醬的影響,結(jié)果顯示發(fā)酵過程中雜色蛤發(fā)酵醬的總酸含量逐漸升高,pH值逐漸降低,氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加,超高壓預(yù)處理組與對照組的變化趨勢相似,但熱處理組的發(fā)酵效果較差,氨基酸態(tài)氮含量增加緩慢,36 h時對照組和超高壓組的氨基酸態(tài)氮含量增加到0.68和0.68 g/100 mL,熱處理組只有0.42 g/100 mL;超高壓預(yù)處理可以降低發(fā)酵時雜色蛤醬中揮發(fā)性鹽基氮、腐胺和尸胺含量的增加,36 h時對照組、超高壓組的揮發(fā)性鹽基氮含量為79.4和65.15 g/100 mL,對照組的腐胺和尸胺含量在36 h時分別為0.64和140.96 mg/L,經(jīng)超高壓預(yù)處理的腐胺含量低于檢測下限,尸胺含量為0.83 mg/L。在感官評價上,超高壓組的感官評價總分最高,對照組、超高壓組總分分別為13.20和18.20,超高壓預(yù)處理可有效降低雜色蛤發(fā)酵醬的腥味和酸味,保證雜色蛤發(fā)酵醬的特殊風(fēng)味不變。因此超高壓殺菌可以作為預(yù)處理方式應(yīng)用于雜色蛤發(fā)酵中,可以降低揮發(fā)性鹽基氮、腐胺和尸胺的含量,提高感官評分,保證發(fā)酵效果,具有提高安全性,并改善感官品質(zhì)的效果。