基于酶聯(lián)適配體快速檢測食品中葡萄球菌腸毒素A

林祥群，楊國江，盧春霞，陶思樺，閆圣坤

（1.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕紡化工分院，新疆 石河子 832000）（2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院水土研究所，新疆 石河子 832000）（3.長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100）（4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所，新疆 烏魯木齊 830091）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引發(fā)食源性疾病的主要致病菌之一，而引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子是葡萄球菌腸毒素（Staphylococcus enterotoxin，SEs）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界上由SEs引起的食物中毒事件占細(xì)菌性食物中毒總事件的25%～45%，其中SEA引起的食物中毒事件占所報道的葡萄球菌中毒病例的80%[1]。因此，如何快速、及時、準(zhǔn)確地檢出SEA是保障食品安全及有效預(yù)防食源性疾病的先決條件。

目前，SEA的鑒定和檢測方法主要包括：（1）分子生物學(xué)方法：該法是基于SEs特異基因序列作為檢測目標(biāo)，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[2]、基因芯片技術(shù)[3]等對目標(biāo)物進(jìn)行快速檢測。該法需要昂貴的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。（2）基于抗原-抗體識別的免疫分析技術(shù)，是目前最常用SEA快速檢測技術(shù)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）[4]、膠體金試紙條[5]和各種生物傳感器[6，7]。但是抗體的制備需要免疫動物，制備周期長、成本高。因此，迫切需要建立簡便、經(jīng)濟(jì)、靈敏、快速的SEA檢測方法，作為現(xiàn)有檢測技術(shù)的補(bǔ)充，滿足批量樣品中SEA的快速篩查。而核酸適配體可彌補(bǔ)抗體在檢測應(yīng)用中的不足，為SEA檢測提供了新的思路。

核酸適配體（Aptamer）是能與特定靶標(biāo)結(jié)合的一段單鏈寡核苷酸，通過折疊成發(fā)夾、莖環(huán)、假結(jié)體及G-四聚體等結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)進(jìn)行特異性分子識別。基于隨機(jī)文庫的龐大庫容和單鏈核苷酸空間結(jié)構(gòu)的多樣性，適配體幾乎可與所有種類的靶標(biāo)包括大到微生物小到有機(jī)小分子[8-16]發(fā)生結(jié)合。相較與抗體，核酸適配體還具有制備簡單、生產(chǎn)成本低、應(yīng)用范圍廣、易于修飾和標(biāo)記等特點(diǎn)[17]。因此，適配體作為一種新型識別探針在食品安全領(lǐng)域成為人們研究的焦點(diǎn)[18-22]。2014年，Huang等[23]篩選出SEA核酸適配體，適配體親和力達(dá)到 nmol/L級別，并通過氧化石墨烯與標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)的SEA適配體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，實(shí)現(xiàn)了對牛奶中SEA的檢測，方法檢出限達(dá)8.7 ng/mL。馬欣月[24]以熒光標(biāo)記的SEA適配體為分子識別元件，利用帶正電荷的金納米棒對核酸的靜電吸附作用，以及對熒光基團(tuán)的猝滅原理，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的SEA檢測方法。在優(yōu)化條件下，SEA線性檢測范圍為0.01～0.8 μg/mL，檢出限為5.66 ng/mL，并將其成功應(yīng)用于牛奶樣品中的SEA檢測。

酶聯(lián)適配體分析技術(shù)是將傳統(tǒng) ELISA中的識別元件抗體替換為核酸適配體，借助酶催化顯色及信號放大作用實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的高靈敏度、高特異性檢測。因此酶聯(lián)適配體分析法有望發(fā)展成為商業(yè)化試劑盒，具有廣闊的市場前景。但目前尚未見到基于酶聯(lián)適配體檢測SEA的研究報道。因此，本研究以SEA適配體為識別分子，基于夾心模式建立了一種簡便、經(jīng)濟(jì)、靈敏的檢測新方法，為SEA檢測提供新的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研宄中所用核酸適配體[23]由生物工程（上海）股份有限公合成并純化。生物素化適配體 1：5’-bio-TACTTATGCATTTCCTCCCACGATCTTATTT GAGAGTGAC-3’；生物素化適配體 2：5’-bio-AGGCGATTACGCTTCTTGTACTTCAATAAC GACTCAACTC-3’。

SEA、SEB、SEC1，上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（Oval abumin，OVA）、吐溫-20（Tween-20）、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（Streptavidin-horseradish peroxidase，SA-HRP）、TMB顯色試劑盒，生物工程（上海）股份有限公司；其余分析純試劑國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SEA ELISA檢測試劑盒，南京卡米洛生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm）；鏈霉親和素包被的酶標(biāo)板，蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；雞肉和牛奶等食品樣品，本地超市。

1.2 儀器設(shè)備

Thermo Scientific?Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，美國Thermo公司；5MX 96孔板混勻儀，美國Scilogex公司；5424R臺式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，美國密理博公司；萬分之一天平，德國Sartorius公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶聯(lián)適配體分析（ELAA）的建立

酶標(biāo)板使用前用PBST緩沖液（10 mmol/LPBS，0.05% Tween-20）洗滌3～5次，拍干。加入200 μL適配體1溶液，室溫孵育，PBST洗滌、拍干。隨后加入300 μL的BSA封閉液，室溫孵育，PBST洗滌。加入200 μL待測樣品，室溫孵育，PBST洗滌。加入200 μL適配體2溶液，室溫孵育一定時間，PBST洗滌。然后加入 200 μL SA-HRP，室溫孵育20 min，PBST洗滌。加入100 μL TMB底物顯色液，反應(yīng)5～7 min后，加入100 μL終止液終止反應(yīng)，通過顏色變化定性檢測SEA。定量檢測時，采用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀在450 nm處測其吸光值。

實(shí)驗(yàn)過程中對適配體濃度、封閉劑BSA濃度、封閉時間、SA-HRP濃度、反應(yīng)體系、靶標(biāo)與適配體反應(yīng)時間等條件進(jìn)行優(yōu)化。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 ELAA檢測性能評價

1.3.2.1 靈敏度

在優(yōu)化條件下，將SEA稀釋成系列梯度濃度，采用ELAA方法進(jìn)行測定，以不同SEA濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以SEA各濃度對應(yīng)的OD450nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對標(biāo)曲進(jìn)行進(jìn)行線性擬合，求得線性方程和相關(guān)系數(shù)。計(jì)算ˉx0+2s（ˉx0和s為10份零標(biāo)準(zhǔn)濃度的吸光值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差），以此該數(shù)據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出對應(yīng)的濃度，即為檢出限（Limit of detection，LOD）[25]。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.2 特異性

采用建立的 ELAA方法分別檢測 SEA、SEB、SEC1、BSA、OVA，同時設(shè)置空白對照（SEA 適配體篩選緩沖液），以評估方法的特異性。

1.3.2.3 加標(biāo)回收率

采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來考察該 ELAA方法的準(zhǔn)確性。取雞肉和牛奶空白樣品，分別添加低、中、高三種濃度水平的SEA。參照GB/T 4789.10-2016[26]中附錄B4.2的方法提取食品中SEA，按照ELAA方法進(jìn)行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各SEA濃度，然后計(jì)算加標(biāo)回收率和其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）。每個添加水平設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

采用批內(nèi)和批間誤差以評估ELAA的精密度。批內(nèi)精密度：分別采集3份SEA添加（陽性）樣品及2份空白（陰性）樣品，采用同一批次的適配體，在同一塊酶標(biāo)板上對樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測，測定OD450nm值，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。批間精密度：按照建立的ELAA方法，采用3個批次的適配體，在同一酶標(biāo)上分別檢測3份陽性樣品和2份陰性樣品，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測定OD450nm值，計(jì)算RSD。

1.4 ELAA方法的應(yīng)用

參照GB/T 4789.10-2016[27]中附錄B4.2的方法提取不同食品中SEA。取200 μL樣品提取液，按照上述ELAA方法進(jìn)行檢測，計(jì)算樣品中SEA含量。同時采用國標(biāo)法（GB/T 4789.10-2016）進(jìn)行檢測，并與檢測結(jié)果對比驗(yàn)證，以評價本方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差方式表示，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，顯著性水準(zhǔn)為α=0.05，使用Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化

2.1.1 適配體濃度

適配體1（bio-apt1）的包被濃度對檢測靈敏度有一定影響。因此，本實(shí)驗(yàn)固定SEA濃度為500 ng/mL，適配體2濃度為100 nmol/L，結(jié)合時間1 h，SA-HRP稀釋比例為 1:40000，考察了不同 bio-apt1包被濃度（10～200 nmol/L）對檢測靈敏度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1a所示。從圖中可以看出，吸光值隨著bio-apt1包被濃度的增加而增加，意味著結(jié)合SEA的量也逐漸增加，當(dāng)bio-apt1包被濃度超過40 nmol/L后，吸光值變化趨于平緩。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇40 nmol/L為bio-apt1的包被濃度。

固定適配體1包被濃度，考察適配體2不同濃度（10～200 nmol/L）對檢測性能的影響，結(jié)果如圖1b所示，吸光值隨著適配體2濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為40 nmol/L時，吸光值變化趨勢平緩。因此，適配體2濃度也選擇40 nmol/L。

2.1.2 封閉條件

在酶聯(lián)適配體分析中，封閉酶標(biāo)版上多余位點(diǎn)至關(guān)重要，若封閉不完全，SA-HRP會與聚苯乙烯板發(fā)生非特異性結(jié)合，造成較高的背景值[27]。本實(shí)驗(yàn)固定適配體濃度為40 nmol/L，采用1% BSA封閉后直接加入 SA-HRP（1:40000，V/V），觀察 BSA濃度和封閉時間對SA-HRP非特異性吸附的影響。結(jié)果顯示（圖2），當(dāng)BSA封閉濃度低于0.5%，封閉不完全，隨著BSA濃度的增加，吸光值逐漸下降，說明SA-HRP非特異性吸附降低。另外，非特異性吸附隨著封閉時間的延長而降低，當(dāng)封閉時間超過4 h后，吸光值無明顯變化。綜上分析，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1% BSA封閉4 h。

2.1.3 反應(yīng)體系對檢測性能的影響

適配體的動態(tài)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性易受環(huán)境變化影響，即反應(yīng)溶液pH、離子成分及濃度等顯著影響適配體的親和力及特異性[28，29]，因此最佳的反應(yīng)緩沖液對檢測性能至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)分別采用SEA適配體篩選緩沖液（20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2和 1 mmol/L MgCl2·6H2O，pH 7.4）[23]和10 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.4）作為反應(yīng)溶液用于稀釋適配體、樣品和 SA-HRP等，考察不同反應(yīng)體系對檢測性能的影響。結(jié)果如圖3所示，篩選緩沖液作為反應(yīng)體系時，吸光顯著高于10 mmol/L PBS緩沖液。有研究證明，在分析過程中，改變適配體反應(yīng)體系及離子強(qiáng)度等環(huán)境條件可能影響適配體的折疊結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響靶標(biāo)與適配體的相互作用[28]，故檢測體系與配體篩選體系之間的一致性對提高檢測性能至關(guān)重要。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SELEX緩沖液作為檢測體系。

2.1.4 反應(yīng)時間

充足的反應(yīng)時間可保障SEA與適配體充分結(jié)合，但反應(yīng)時間過長，則會影響檢測效率。因此，本實(shí)驗(yàn)調(diào)查了不同反應(yīng)時間對檢測性能的影響。結(jié)果如圖4顯示，隨著結(jié)合時間的增加，吸光值逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時間超過 30 min后，吸光值沒有明顯變化。表明SEA與適配體反應(yīng)30 min即達(dá)到平衡狀態(tài)，延遲反應(yīng)時間并沒有提高檢測靈敏度。所以，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時間為30 min。

2.1.5 SA-HRP稀釋比例

SA-HRP是酶聯(lián)適配體顯色反應(yīng)的關(guān)鍵因素，SA-HRP濃度低，顯色反應(yīng)不充分，濃度過高易引起非特異性吸附。本研究固定以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，將SA-HPR稀釋不同比例（1:10000～1:100000），檢測結(jié)果如圖5所示，當(dāng) SA-HRP稀釋比例在 1:10000～1:40000范圍時，吸光值無明顯變化，隨著稀釋比例進(jìn)一步增大，吸光值顯著降低。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SA-HRP稀釋比例為1:40000。

2.2 檢測性能評價

2.2.1 靈敏度

在優(yōu)化條件下，采用ELAA方法測定不同濃度的SEA（0、1、5、10、50、100、500、1000、5000 ng/mL），以SEA不同濃度為橫坐標(biāo)，以各濃度對應(yīng)的OD450nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6為SEA的劑量反應(yīng)曲線（外）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（內(nèi)），如圖6a所示，OD450nm值隨SEA濃度的增加而增大，SEA在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)與OD值呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）為0.996。基于ˉx0+2s計(jì)算方法檢出限為0.18 ng/mL。同時溶液顏色的變化與 OD450nm值的變化一致（圖6b），在SEA濃度1 ng/mL時，溶液顯色呈藍(lán)色，故該方法目測可視化檢測限為1 ng/mL。以上結(jié)果表明，本方法具有高的靈敏度。

2.2.2 特異性分析

采用ELAA分別檢測SEA、SEB、SEC1、BSA、OVA，同時設(shè)置空白對照（結(jié)合緩沖液），以評估方法的特異性。結(jié)果見圖7所示，BSA、OVA不產(chǎn)生識別信號，與空白對照吸光值相近，說明適配體與無關(guān)蛋白沒有交叉反應(yīng)。但適配體與SEB和SEC1有一定交叉反應(yīng)，吸光值約 0.12～0.13。這與適配體本身特異性有關(guān)，推斷原因在于 SEA與 SEB、SEC1具有40%～60%序列同源性，適配體對該共同結(jié)構(gòu)域具有相同的識別位點(diǎn)[23]。

2.2.3 加標(biāo)回收率

利用所建立的檢測方法，對空白樣品進(jìn)行添加回收測定，進(jìn)一步評價該方法的準(zhǔn)確性和精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，SEA在空白樣品中的平均回收率為91.22%～101.30%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于6.00%。以上結(jié)果說明所建立的 ELAA方法具有較高的準(zhǔn)確性。

表1 本方法檢測食品中SEA的加標(biāo)回收率（n=3）Table 1 Recovery rates of SEA spiked from the food by the developed method (n=3)

2.2.4 重復(fù)性

采用批內(nèi)和批間誤差評估本方法的精密度。研究結(jié)果顯示，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.82%～5.00%（表2），批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.33%～7.50%（表3），結(jié)果表明批間和批內(nèi)重復(fù)性良好，本方法具有高的精密度。

表2 批內(nèi)精密度（n=3）Table 2 The precision of intra-batch (n=3)

表3 批間精密度（n=3）Table 3 The precision of inter-batch (n=3)

2.3 SEA檢測方法比較

本研究以適配體代替抗體建立的ELAA方法，具有較高的靈敏度和回收率（見表4），與基于適配體的熒光傳感檢測方法比較，本方法不需要制備納米材料和對適配體過多修飾，不需要特殊的儀器，簡化了操作步驟。與基于抗體的免疫檢測技術(shù)比較，本方法所用適配體可體外篩選獲得（1～2周）和人工合成，具有制備周期短、成本低等優(yōu)勢，可極大降低檢測成本。

表4 本方法與文獻(xiàn)報道方法的檢測性能比較Table 4 Comparison of detection performance of between proposed method and reported methods

2.4 檢測方法應(yīng)用

為了驗(yàn)證本方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果，分別采用本方法與國標(biāo)方法測定10組加標(biāo)樣本，計(jì)算樣品中SEA含量。以本方法測定值為X軸，國標(biāo)法測定值為Y軸作圖，將二者濃度值進(jìn)行相關(guān)性分析。從圖8中可以看出，兩種方法的檢測結(jié)果具有高的相關(guān)性（R2=0.994），表明建立的方法準(zhǔn)確度和可靠性較好。

3 結(jié)論

本研究以SEA適配體為識別分子，代替抗體建立了一種酶聯(lián)適配體分析方法，在優(yōu)化條件下，該方法具有低的檢測限（0.18 ng/mL）、高的回收率（91.22%～101.30%）和精密度（RSD＜8%）。將建立的ELAA應(yīng)用于食品中SEA檢測，檢測結(jié)果與國標(biāo)法相關(guān)性較高（R=0.994）。且該方法操作簡單，適用于批量樣品中SEA的高通量快速篩查。本研究為SEA檢測提供一張簡便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的快速檢測新技術(shù)。