木瓜、酒木瓜、光皮木瓜的HPLC指紋圖譜鑒別

陳建真， 敖志輝， 陳 彬， 笈文娜， 呂圭源

(1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomelesspeiosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果實，味酸性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有舒筋活絡、和胃化濕的功效，用于治療濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉(zhuǎn)筋痙攣、腳氣水腫[1]。臨床上木瓜多經(jīng)炮制后使用，如酒制品具有引藥上行、增強活血行氣止痛等作用。木瓜種類繁多，主要有皺皮木瓜、光皮木瓜2大類，前者為木瓜的主流商品，后者為木瓜的習用品或混用品，為同屬植物榠楂Chaenomelessinensis(Thouin) Koehne的干燥成熟果實[2]。由于傳統(tǒng)用藥習慣的影響，市場上常有將光皮木瓜作木瓜使用的情況，影響木瓜的臨床療效。

木瓜和光皮木瓜含有三萜、有機酸、黃酮、多糖等成分[2-4]，但在具體成分及成分含量上差異較顯著。劉世堯等[5]測定了木瓜和光皮木瓜總糖、可滴定酸、抗壞血酸、齊墩果酸、熊果酸、總黃酮、總皂苷等含量，多數(shù)指標為木瓜高于光皮木瓜，并采用模糊概率法進行綜合評價，表明木瓜綜合品質(zhì)明顯高于光皮木瓜。齊紅等[6]利用HPLC轉(zhuǎn)化波長法測定了木瓜屬5種木瓜中齊墩果酸、熊果酸、綠原酸含量，顯示木瓜含量較高，光皮木瓜含量較少。于曉亮等[7]對木瓜和光皮木瓜綠原酸、齊墩果酸、熊果酸和總黃酮進行了測定，表明在光皮木瓜中未檢測到綠原酸，且齊墩果酸含量極低，總黃酮含量以木瓜較高，光皮木瓜較少。劉曉棠等[8]采用直接電位滴定法對總有機酸含量進行測定，表明皺皮木瓜中含量高于光皮木瓜。Du等[9]采用HPLC-DAD法和ESI-MS法對5種木瓜含有的黃酮類成分進行研究，表明表兒茶酸、原花青素在光皮木瓜和日本木瓜中含量較高，皺皮木瓜次之。受炮制時間、溫度和輔料等影響，木瓜經(jīng)炮制后所含部分成分含量會發(fā)生變化，如齊墩果酸、綠原酸、熊果酸、咖啡酸、沒食子酸和皂苷[10]。

木瓜傳統(tǒng)的藥用評價是“味酸者為佳”，有機酸是木瓜鎮(zhèn)痛、抗炎等作用的重要有效成分，包括脂溶性的三萜酸如齊墩果酸、熊果酸，中等極性的酚酸如綠原酸、咖啡酸等，水溶性有機酸如蘋果酸、檸檬酸等[11-12]。2020年版《中國藥典》一部以齊墩果酸和熊果酸的總含量控制木瓜的質(zhì)量[1]，為了建立木瓜多指標質(zhì)量控制的方法，本課題組在前期用HPLC法對木瓜及其酒制品中齊墩果酸、熊果酸和綠原酸含量測定的基礎上[13-14]，采用梯度洗脫法建立木瓜HPLC指紋圖譜，對木瓜、酒木瓜、光皮木瓜進行比較，為木瓜的鑒別和質(zhì)量評價提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 Series高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q SynthesisA10純水儀(美國Millipore公司)；KQ5200B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XS105型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試劑與藥物 10批木瓜飲片、2批光皮木瓜飲片經(jīng)浙江省中醫(yī)院陳建明主管藥師鑒定為正品，具體信息見表1；酒木瓜飲片為自制。綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院)。乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考文獻[14]報道，Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-甲醇(B)-1%冰醋酸(C)，梯度洗脫，程序見表2；檢測波長283 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為273.6 μg/mL的溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 木瓜信息

表2 梯度洗脫程序

2.3 供試品溶液制備 取不同批次木瓜飲片粉末各約1 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，冷卻至室溫，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 吸取同一供試品溶液(S10)，按“2.1”項色譜條件下進樣測定5次，以3號峰(綠原酸)為參照，測得各共有峰相對保留時間RSD為0～0.18%，相對峰面積RSD為0～4.33%(除2號峰外其余均小于3%)，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 吸取同一供試品溶液(S10)，于0、3、6、12、24 h按照“2.1”項色譜條件下進樣測定5次，以3號峰(綠原酸)為參照，測得各共有峰相對保留時間RSD為0～0.37%，相對峰面積RSD為0～2.93%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗 稱取同一批木瓜飲片粉末(S10)5份，各約1 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下進樣測定5次，以3號峰(綠原酸)為參照，測得各共有峰相對保留時間RSD為0～0.43%，相對峰面積RSD為0～4.60%，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜建立 稱取10批木瓜飲片粉末約1 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A版)對10批樣品進行分析，見圖1，共確定7個共有峰。與對照品比對后，可知3號峰為綠原酸，其含量較高、分離度較好，故選擇其作為參照峰[編號3(s)]，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表3～4。由此可知，不同產(chǎn)地、批次樣品主成分組成基本相同，但各成分含量存在差異，并且相似度均大于0.9。

圖1 10批樣品HPLC指紋圖譜

表3 共有峰相對保留時間

表4 共有峰相對峰面積

2.6 木瓜、酒木瓜HPLC圖譜比較 稱取酒木瓜飲片粉末約1 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，見圖2，它與木瓜的指紋峰數(shù)據(jù)見表5，并且相似度均大于0.9。由此可知，木瓜酒制前后共有峰數(shù)量一致，表明其成分種類無明顯變化；但酒制品峰面積大于生品，與文獻[13,15]報道一致。

表5 木瓜、酒木瓜指紋峰保留時間和峰面積

2.7 木瓜、光皮木瓜HPLC圖譜比較 稱取光皮木瓜飲片粉末約1 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，見圖3，它與木瓜指紋峰數(shù)據(jù)見表6，并且相似度均為0.6。由此可知，光皮木瓜未檢測到木瓜中原有的2號、3號(綠原酸)、4號峰，與文獻[7]報道光皮木瓜中未檢測到綠原酸一致。

圖3 光皮木瓜HPLC色譜圖

表6 木瓜、光皮木瓜指紋峰保留時間

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 本實驗中考察了甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸和甲醇-乙腈-0.1%磷酸的分離效果，確定了乙腈-甲醇-1%冰醋酸的梯度洗脫條件，色譜峰數(shù)目多，基線平穩(wěn)，分離度較好。結(jié)合木瓜所含的化學成分，比較了220、283、326 nm等不同波長下的圖譜，結(jié)果在220 nm處干擾較大，在326 nm處出峰數(shù)目較少，在283 nm處圖譜所反映的信息較多，分離度較好，故選擇283 nm作為測定波長。

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化 采用水、乙醇、甲醇、80%甲醇、60%甲醇等不同溶劑進行提取，結(jié)果以甲醇提取所得的色譜峰較多，峰面積較大，故選用甲醇為提取溶劑。對超聲和回流提取方法進行比較，表明兩種方法所得圖譜基本相似，由于超聲提取方便省時，故選擇超聲提取。對提取時間進行考察，結(jié)果提取1 h比45 min所得的峰面積較大，故確定超聲提取1 h。

3.3 相似度結(jié)果分析 中藥指紋圖譜具有“整體性”與“模糊性”的特點，HPLC指紋圖譜能較全面地反映所含成分的相對關(guān)系，能更好地鑒別中藥品質(zhì)及其炮制品，控制和評價藥材的質(zhì)量，為中藥規(guī)范化炮制及其機制研究提供依據(jù)[16-17]。相似度是反映不同樣品之間相關(guān)性的重要參數(shù)，實驗結(jié)果顯示同一品種的木瓜因所含成分基本一致，故相似度較高，但由于受產(chǎn)地、生長環(huán)境、采收季節(jié)等影響含量不同，色譜峰面積存在差異。木瓜酒制后色譜峰位置基本相同，共有峰數(shù)目無變化，色譜峰面積有差異，表明酒制對木瓜中化學成分的影響主要在于改變成分間的比例關(guān)系，而對成分種類無明顯影響，故相似度較高。光皮木瓜和木瓜系兩個不同的品種，成分差異較大，故相似度較低，該指紋圖譜可用于兩者的鑒別。

3.4 對木瓜酒制工藝及其機制研究的意義 酒制升提是中藥炮制理論的重要組成部分，酒制有引藥上行，緩解藥性的作用[18]，酒制一方面使酒與藥物協(xié)同發(fā)揮作用，增強活血通絡作用，另一方面使藥物有效成分易于煎出而增強療效。酒制工藝條件如用酒量、炮制溫度、時間等因素均會影響有效成分的溶出，導致質(zhì)量不一，通過HPLC指紋圖譜的相似性可用以反映木瓜酒制工藝是否穩(wěn)定良好，從而保證飲片質(zhì)量。實驗結(jié)果表明木瓜酒制品的總峰面積大于生品的總峰面積，系因其所含的有機酸、萜類、黃酮等有效成分溶于乙醇，酒制后有利于成分溶出，從化學角度為酒制有利于療效增強提供了依據(jù)。由于本實驗所建立的指紋圖譜僅能反映此色譜條件下的化學成分信息，酒制后其他成分含量及藥效作用變化還有待深入研究。