紅花清肝十三味丸對(duì)急性肝損傷大鼠的影響

盧任玲， 馬麗杰

(1.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264210；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

急性肝損傷通常是由于微生物感染、濫用藥物、過度飲酒等造成的肝功能突然異常，是肝硬化和肝癌的主要始動(dòng)因素。若未及時(shí)治療會(huì)迅速惡化，可能會(huì)發(fā)展成為急性肝衰竭[1]。目前國內(nèi)外尚無理想的治療肝損傷藥物，因此開發(fā)及篩選有效藥物逆轉(zhuǎn)肝損傷的發(fā)生發(fā)展已成為目前研究的熱點(diǎn)。臨床上針對(duì)急性肝損傷，多采用保肝降酶等治療方案，以改善其臨床癥狀，促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進(jìn)展，中藥在治療急性肝損傷起到了很好的臨床療效，逐漸成為研究熱點(diǎn)[2-3]。

紅花清肝十三味丸出自《中國醫(yī)學(xué)百科全書·蒙醫(yī)學(xué)》，是由紅花、牛黃、紫檀香3味主藥，水牛角、木香、梔子、川楝子、訶子、麥冬等10味輔藥組成的中藥復(fù)方制劑。蒙醫(yī)認(rèn)為，該復(fù)方中的君藥紅花可以清肝熱，調(diào)經(jīng)、活血消腫；梔子、紫檀香可以清血熱；銀朱可以清脈熱；水牛角可以清熱、涼血、解毒；麥冬可以清希拉熱。各藥合用對(duì)治療肝熱癥及肝功減退有很好的療效[4]。研究證明，紅花清肝十三味丸在臨床治療慢性脂肪性肝炎、慢性乙型肝炎療效顯著[5-6]。然而，在治療急性肝損傷方面的研究仍然匱乏。本研究旨在建立CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型，研究紅花清肝十三味丸對(duì)急性肝損傷大鼠的保護(hù)作用，并初步探究其作用機(jī)制，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量(200±20) g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK-(軍)2012-0004，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，每天光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 試劑與藥物 紅花清肝十三味丸 (批號(hào)168172) 購自內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司；水飛薊賓膠囊 (批號(hào)H20040299) 購自天士力制藥集團(tuán)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT，批號(hào)C009-3-1)、堿性磷酸酶 (ALP，批號(hào)A059-1-1)、總蛋白 (TP，批號(hào)A095-2-1)、丙二醛 (MDA，批號(hào)A003-1-2)、過氧化氫酶 (CAT，批號(hào)A007-1-1) 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號(hào)BC1195) 檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TNF-α (批號(hào)ab6671)、IL-6 (批號(hào)ab208113)、iNOS (批號(hào)ab3523)、caspase-3 (批號(hào)ab13847)、cleaved caspase-3 (批號(hào)ab2302) 抗體購自英國Abcam公司；IL-1β(批號(hào)12703s) 購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 藥物配制 藥物研磨成細(xì)粉后過篩，加1%吐溫80研磨均勻，加蒸餾水溶解并稀釋，分別配成質(zhì)量濃度為0.025、0.05、0.1 g/mL 的紅花清肝十三味丸灌胃液和質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的水飛薊賓灌胃液，用前搖勻。將CCl4與花生油按1∶1比例混勻，配制造模液。

1.4 儀器 CTR6000熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Centrifuge 5415R低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像分析儀(北京原平皓生物技術(shù)公司)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀、HM355S全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(美國Thermo公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 48只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，紅花清肝十三味丸低、中、高劑量組 (0.25、0.5 g、1 g/kg，分別相當(dāng)于臨床成人日用量0.5、1、2倍的等效量)，水飛薊賓組 (0.1 g/kg)，每組8只，正常對(duì)照組和模型組灌胃給予蒸餾水，其余各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，給藥量均為1 mL/100 g，每天1次，持續(xù)8 d。

2.2 模型的建立 末次灌胃給藥1 h后，正常對(duì)照組大鼠腹腔注射1 mL/kg的花生油，模型組、給藥組大鼠注射同樣劑量的造模液，給藥量均為0.1 mL/100 g。大鼠禁食不禁水24 h后，水合氯醛麻醉處死，剝離肝臟。

2.3 生化指標(biāo)檢測 按照試劑盒說明，將各組血液以3 500 r/min離心10 min，取上清液，檢測血清ALT、ALP、TP 水平；取大鼠肝臟，制備肝組織勻漿，檢測MDA水平及CAT、GSH-Px活性。

2.4 肝組織形態(tài)學(xué)檢測 取大鼠肝臟右小葉組織于10%福爾馬林固定后，經(jīng)組織脫水、透蠟、包埋、切片、脫脂脫蠟后蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)改變。

2.5 肝細(xì)胞凋亡率檢測 取少量新鮮大鼠肝組織加入胰酶，恒溫37 ℃消化30 min，10%胎牛血清終止消化，收集細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS洗滌2次，棄上清，加人膜聯(lián)蛋白V-碘化丙啶(Annexin V-PI) 進(jìn)行聯(lián)合染色，上機(jī)檢測凋亡率。

2.6 肝組織炎癥、凋亡蛋白檢測 采用Western blot法。取大鼠肝臟組織，加入預(yù)冷的RIPA裂解液提取蛋白后測定其濃度，SDS-PAGE凝膠分離蛋白并轉(zhuǎn)移至NC膜上，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗稀釋液，4 ℃冰箱過夜；TBST洗滌3次，加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL發(fā)光液顯影和定影，使用Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像分析儀掃描，統(tǒng)計(jì)灰度值并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果以待測因子與β-actin條帶灰度值的相對(duì)比值表示(待測因子正常組比值為1)。

3 結(jié)果

3.1 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝功能指標(biāo)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、ALP水平升高(P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組、水飛薊賓組大鼠兩者水平降低(P<0.01)；急性肝損傷后，各組大鼠血清TP水平無顯著差異 (P>0.05)，見表1。

表1 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝功能指標(biāo)的影響

3.2 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟組織中MDA水平升高 (P<0.01)，CAT、GSH-Px活性降低(P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組、水飛薊賓組大鼠肝臟MDA水平降低(P<0.01)，紅花清肝十三味丸中、高劑量組和水飛薊賓組大鼠CAT、GSH-Px活性升高(P<0.01)，見表2。

表2 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

3.3 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖1所示，正常對(duì)照組大鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，小葉肝板排列整齊，未見明顯炎癥；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈周圍多數(shù)融合壞死，多數(shù)肝細(xì)胞腫脹呈氣球樣變，易見凋亡小體，竇細(xì)胞反應(yīng)活躍，伴混合性炎細(xì)胞浸潤；而紅花清肝十三味丸組和水飛薊賓組肝小葉損傷程度明顯改善，中央靜脈周圍小壞死灶和凋亡小體明顯減少，炎細(xì)胞浸潤明顯減輕。

3.4 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝臟炎癥指標(biāo)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的蛋白表達(dá)升高 (P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組、水飛薊賓組四者蛋白表達(dá)降低 (P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表3、圖2。

3.5 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 如表4、圖2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織cleaved caspase-3表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組大鼠肝組織cleaved caspase-3表達(dá)降低(P<0.01)，但各組caspase-3蛋白表達(dá)無顯著差異 (P>0.05)。

圖1 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響

表3 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝臟炎癥指標(biāo)的影響

注：A為正常對(duì)照組，B為模型組，C為紅花清肝十三味丸低劑量組，D為紅花清肝十三味丸中劑量組，E為紅花清肝十三味丸高劑量組，F(xiàn)為水飛薊賓組。圖2 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝臟炎癥和凋亡蛋白表達(dá)的影響

表5、圖3顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組和水飛薊賓組肝細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)。

4 討論

肝臟作為人體中最大的消化腺，在機(jī)體解毒和主代謝中的作用舉足輕重[7]。近年來，中藥材被廣泛用于治療肝病。紅花清肝十三味丸作為蒙醫(yī)傳統(tǒng)藥方，在保肝方面具有極高的藥用價(jià)值[8]。CCl4可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基，破壞肝細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜通透性增強(qiáng)，最終引起血清ALT和ALP水平升高，二者通常作為診斷肝損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清ALT和ALP水平升高。此外，臨床診斷通常通過肝臟病理改變作為急性肝損傷的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。本研究的病理切片染色結(jié)果表明，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈周圍和小葉周圍帶可見多數(shù)壞死灶，多數(shù)肝細(xì)胞腫脹呈氣球樣變，伴混合性炎細(xì)胞浸潤，竇細(xì)胞反應(yīng)活躍，結(jié)合血清指標(biāo)表明急性肝損傷模型建立成功。而紅花清肝十三味丸組能使ALT、ALP 水平降低，且能抑制CCl4引起肝臟的病理學(xué)改變和損傷，表明其在保護(hù)肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性及減輕肝臟損傷程度上起著重要作用。此外，紅花清肝十三味丸對(duì)蛋白合成相關(guān)的TP作用并不顯著，這表明其保肝作用并不影響肝臟合成蛋白功能。

表4 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝臟凋亡蛋白的影響

圖3 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡率的影響

表5 紅花清肝十三味丸對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡率的影響

機(jī)體含有多種酶促(例如，GSH-Px和CAT)和非酶促(例如，抗壞血酸)的抗氧化劑，以維持內(nèi)源性氧化還原平衡。CCl4可通過誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，使得平衡被打破，造成肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞、線粒體等生物膜的流動(dòng)性降低，通透性增高，組織內(nèi)抗氧化酶活性降低，肝臟抵御氧化損傷能力下降，進(jìn)而引起肝臟損傷[11]。MDA是自由基攻擊生物膜多不飽和脂肪酸最終產(chǎn)物，通常用于監(jiān)測脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅花清肝十三味丸組能提高CAT、GSH-Px活性，減少M(fèi)DA積聚，表明藥物通過增加抗氧化酶的活力，清除自由基及減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕CCl4引起的肝損傷。

大多數(shù)肝損傷的病理進(jìn)程都伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，肝臟氧化應(yīng)激與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。氧化應(yīng)激能夠激活機(jī)體的Kupffer 細(xì)胞，釋放出大量的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等，而這些介質(zhì)能作用于內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞，隨后募集免疫細(xì)胞以引發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。此外，當(dāng)肝組織損傷時(shí)，肝臟中大量表達(dá)iNOS，催化大量NO產(chǎn)生，參與肝炎的發(fā)病過程，對(duì)肝臟具有毒性作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，紅花清肝十三味丸組能夠抑制模型組 TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS蛋白的表達(dá)，表明藥物通過抑制炎癥反應(yīng)減輕CCl4引起的肝損傷。

細(xì)胞凋亡在肝炎的產(chǎn)生、發(fā)展中的作用至關(guān)重要。caspase-3對(duì)凋亡具有執(zhí)行功能，當(dāng)caspase-3被激活后斷裂為cleaved caspase-3片段，則會(huì)啟動(dòng)凋亡過程，是凋亡發(fā)生的直接原因[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肝細(xì)胞的凋亡率升高，凋亡蛋白cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)增加，紅花清肝十三味丸組能明顯抑制二者的升高，表明藥物通過抑制凋亡減輕CCl4引起的肝損傷。

綜上所述，紅花清肝十三味丸可通過抑制氧化損傷、炎癥反應(yīng)，減輕肝細(xì)胞凋亡，來改善大鼠的急性肝損傷。然而，關(guān)于紅花清肝十三味丸在發(fā)揮保肝作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。