興安升麻UPLC指紋圖譜及4種酚酸類質(zhì)量標(biāo)志物測定

康 璐， 李鈺潔， 王 曉， 章弘揚(yáng)， 張 敏， 胡 坪*

(1.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能性材料化學(xué)重點實驗室，上海 200237；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海市新藥設(shè)計重點實驗室，上海 200237)

升麻是毛茛科植物升麻、大三葉升麻或興安升麻的干燥根莖[1]，性味辛，歸肺、脾、胃、大腸經(jīng)，具有發(fā)表透疹、清熱解毒、升舉陽氣等功效[2]。升麻為多基原藥材，在我國產(chǎn)地分布范圍較廣，不同基原升麻的化學(xué)成分和含量存在一定差異, 其藥理活性及臨床療效也有所不同[3]。翁倩倩等[4]對經(jīng)典名方中所用升麻類藥材的名稱、基原、道地產(chǎn)地等信息進(jìn)行了考證，結(jié)果表明古代藥用升麻的來源主要為升麻，次為興安升麻、大三葉升麻和其他非正品植物。近些年，隨著升麻用量的不斷增加，人工栽培的興安升麻逐漸取代升麻而成為市場上主流的升麻正品藥材。然而，人工栽培的升麻質(zhì)量良莠不齊，市場上升麻品種魚龍混雜，因此開發(fā)有效的方法來鑒別興安升麻并控制其內(nèi)在質(zhì)量具有顯著意義。

升麻中的主要化學(xué)成分為酚酸類[5-6]、三萜及其苷類[7-8]和色原酮類[9-10]等。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)以異阿魏酸的含量作為判斷升麻藥材是否合格的主要指標(biāo)，然而，根據(jù)中醫(yī)藥理論和實踐，中藥是靠多種藥效成分共同發(fā)揮作用[11]，因此僅以單一指標(biāo)成分定量分析難以反映升麻的整體質(zhì)量。為此，本實驗建立了興安升麻UPLC指紋圖譜，并選取阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F作為質(zhì)量標(biāo)志物，開展多指標(biāo)成分定量方法研究，以期為興安升麻內(nèi)在質(zhì)量的整體評價提供思路，亦為含有升麻藥材的經(jīng)典名方開發(fā)提供參考。

1 材料

Waters Acquity Arc超高效液相色譜儀，配PDA二極管陣列檢測器(美國Waters公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；實驗室級超純水發(fā)生器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；塞多利斯CPA225D分析天平(德國塞多利斯公司)；800Y型高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市鉑歐五金制品有限公司)；DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

阿魏酸對照品(批號110773-201614)和異阿魏酸對照品(批號111698-201103)購自中國食品藥品檢定研究院；升麻酸B和升麻酸F均為實驗室自制，采用紅外光譜、電噴霧質(zhì)譜和核磁共振波譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。乙腈和甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。3個不同產(chǎn)地的15批升麻藥材及5批升麻飲片(編號S1～S20)，信息見表1，由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)河北省食品藥品檢驗院孫寶惠主任中藥師鑒定為毛茛科植物興安升麻Cimicifugadahurica(Turcz) Maxim的干燥根。

表1 20批樣品相似度

2 方法與結(jié)果

2.1 興安升麻UPLC指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)，洗脫梯度(0～11 min，2%～9%B，11～15 min，9%～16%B，15～35 min，16%～28%B)；體積流量0.25 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；檢測波長220 nm。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品粉末(過2號篩)約0.5 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用30%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.1.3 對照品溶液制備 取異阿魏酸對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.1.4 UPLC指紋圖譜方法學(xué)驗證 取同一份興安升麻供試品溶液(S2)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，對儀器的精密度進(jìn)行考察。取同一批升麻，平行制備6份供試品溶液，記錄色譜圖，對供試品溶液制備的重復(fù)性進(jìn)行考察。取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，對供試品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。分別計算圖1中11個特征峰(1～11號峰)相對于5號峰異阿魏酸(S)的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗中，各特征峰相對保留時間的RSD均小于1.30%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，方法驗證結(jié)果符合指紋圖譜分析的要求。

2.1.5 興安升麻UPLC指紋圖譜測定及相似度評價 采用“2.1.1”項下的色譜方法，對15批興安升麻藥材和5批飲片的供試品溶液進(jìn)行分析，典型的興安升麻UPLC指紋圖譜見圖1。通過對上述20批興安升麻的指紋圖譜對比分析，選取分離度良好，峰形對稱的11個共有峰作為特征峰。其中將5號色譜峰(異阿魏酸)定為指紋圖譜的參照峰。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012)對20批興安升麻的UPLC指紋圖譜相似度進(jìn)行了評價，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地興安升麻指紋圖譜的相似度在0.896～0.998之間，同一產(chǎn)地的興安升麻藥材與飲片的指紋圖譜亦具有較高的相似度。表明本實驗所選取的不同產(chǎn)地的興安升麻內(nèi)在質(zhì)量較為一致，且飲片的炮制過程對指紋圖譜的相似度影響不大。

5(S)異阿魏酸5 (S) isoferulic acid圖1 20批樣品UPLC指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of twenty batches of samples

2.2 4種酚酸類成分含量測定

2.2.1 色譜條件 檢測波長為316 nm，其他條件同“2.1.1”項。

2.2.2 對照品溶液制備 分別取阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F對照品適量，精密稱定，置5 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成質(zhì)量濃度為1.054、1.016、1.072、1.026 mg/mL的對照品貯備液。吸取上述各對照品貯備液適量，制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，于4 ℃下保存。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過2號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲40 min，冷卻，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗 分別吸取空白溶液、混合對照品溶液及供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果顯示，空白溶液對供試品測定無干擾，4種酚酸成分峰形對稱，分離度良好，滿足定量分析要求。

2.2.4.2 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)。另取阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B及升麻酸F對照品溶液，不斷稀釋，在“2.2.1”項色譜條件下測定，分別選取10倍信噪比(S/N=10)和3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限和檢測限，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4種酚酸成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4.3 精密度試驗 取S1供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣分析6次，記錄色譜圖。測得阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F含量的RSD值均小于1.71%，表明儀器精密度良好。

1. 阿魏酸 2. 異阿魏酸 3. 升麻酸 B 4. 升麻酸 F1.ferulic acid 2.isoferulic acid 3.cimicifugic acid B4.cimicifugic acid F圖2 各成分UPLC色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系

2.2.4.4 重復(fù)性試驗 按“2.2.3”項下方法平行制備S1供試品溶液共6份，在“2.2.1”項色譜條件下分別進(jìn)樣分析，測得阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F含量的RSD值均小于4.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取S1供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測得阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F含量的RSD值均小于4.48%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次升麻樣品6份，每份0.25 g，分別加入阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F對照品8.20×10-3、0.159、1.675、1.603 mg，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見表3。

2.2.5 樣品含量測定 采用已驗證的定量方法對20批興安升麻供試品溶液中阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表4。由表可見，20批興安升麻藥材和飲片中，阿魏酸和異阿魏酸的含量分別介于0.008%～0.018%和0.061%～0.120%，均值分別為0.011%和0.089%，含量均較低。而升麻酸B和升麻酸F的含量分別介于0.228%～1.235%和0.661%～1.373%，均值分別為0.633%和0.995%，含量均較高，為興安升麻中主要的酚酸類成分。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表4 各成分含量測定結(jié)果(%，n=3)

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 考察了流動相、柱溫和體積流量對分離的影響。結(jié)果表明，“2.1.1”項條件下，色譜峰信息最為豐富，各特征峰的峰形對稱，分離度良好，適用于指紋圖譜分析。當(dāng)波長為316 nm時，4個待測酚酸類成分響應(yīng)均較高，且附近無雜質(zhì)干擾，適用于定量研究。

3.2 提取條件選擇 對提取溶劑、提取時間和提取溶劑體積進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，采用25 mL、30%甲醇溶液超聲提取30 min時，供試品的譜峰信息最為豐富，各特征峰峰形良好且響應(yīng)值均較高。參照2020年版《中國藥典》，采用回流法對興安升麻中酚酸類成分進(jìn)行提取。研究了回流時間對4種酚酸類成分的提取效率影響。結(jié)果表明，隨著回流時間的增長，供試品溶液中升麻酸B和升麻酸F的含量逐漸降低，而阿魏酸和異阿魏酸的含量逐漸升高。這可能是由于在較高溫度下升麻酸A和E會逐漸水解生成阿魏酸，而升麻酸B和F水解生成異阿魏酸，又由于升麻酸B和F的含量高于升麻酸A和E，所以生成異阿魏酸的含量明顯高于阿魏酸[12-13]。因此，本實驗采用溫和的超聲法替代回流法制備供試品溶液，考察了超聲時間、提取溶劑和提取溶劑體積對4種酚酸成分提取效率的影響。結(jié)果顯示，采用25 mL的70%甲醇，超聲提取30 min時，各成分的提取效率最高。

3.3 酚酸類質(zhì)量標(biāo)志物含量測定的討論 參考文獻(xiàn)[14]報道，本實驗提出以阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F作為興安升麻的質(zhì)量標(biāo)志物，對其藥材和飲片進(jìn)行質(zhì)量評價與控制。這是由于(1)阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F是升麻中固有的，且與其功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)成分[15-17]；(2)酚酸類物質(zhì)極性較強(qiáng)，是升麻在經(jīng)典名方、配方顆粒等水煎制劑中的主要有效成分[18]；(3)升麻酸B和升麻酸F在興安升麻藥材和飲片中均存在且含量相對較高，與阿魏酸和異阿魏酸同為升麻屬的特征性成分，具有較強(qiáng)的專屬性。

表2顯示，4種酚酸類質(zhì)量標(biāo)志物在20批興安升麻中的含量差異較大。表明同基原不同產(chǎn)地的興安升麻藥材中的酚酸含量具有較大差別。此外，對比遼寧鞍山產(chǎn)藥材和飲片(S11～S15)發(fā)現(xiàn)，飲片中阿魏酸和異阿魏酸的含量遠(yuǎn)高于藥材，而升麻酸B和升麻酸F的含量明顯偏低。這可能是潤透、干燥等飲片炮制過程使酚酸類成分發(fā)生了部分水解，導(dǎo)致升麻酸B和升麻酸F的含量下降，阿魏酸和異阿魏酸的含量升高。

4 結(jié)論

本實驗提出以阿魏酸、異阿魏酸、升麻酸B和升麻酸F作為興安升麻的質(zhì)量標(biāo)志物，建立了興安升麻UPLC指紋圖譜，并測定4種酚酸類質(zhì)量標(biāo)志物，以期從整體上把控興安升麻的質(zhì)量，也為含有升麻藥材的經(jīng)典名方開發(fā)提供參考。