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    石杉堿甲二元醇質(zhì)體溫敏凝膠大鼠鼻腔給藥藥動學(xué)及腦靶向性研究

    2022-02-25 09:37:42陳筱瑜馮連晶黃慶德馮玉天嬌
    中成藥 2022年2期
    關(guān)鍵詞:石杉溫敏內(nèi)標(biāo)

    陳筱瑜, 馮連晶, 黃慶德*, 馮玉天嬌

    (1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,福建 福州 350101;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

    石杉堿甲是從民間草藥千層塔(蛇足石杉)中分離得到的一種石松類生物堿,為有效的、競爭性的、可逆性的乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑[1],常用于增強(qiáng)阿爾茨海默患者記憶功能[2-3],目前上市的相關(guān)制劑有片劑、膠囊劑、注射劑(肌內(nèi)),但它們均缺乏腦選擇性,導(dǎo)致其不良反應(yīng)發(fā)生會隨劑量增大而增加。鼻腔給藥是目前比較理想的腦靶向給藥途徑,其特點是吸收快,生物利用度高,可避免首過效應(yīng),而且使用方便[4-6]。

    醇質(zhì)體由磷脂(2%~5%)、乙醇(20%~50%)、水組成,是一種多層囊泡結(jié)構(gòu),其雙分子層流動性較高,易于變形可穿透皮膚(黏膜)屏障。宋艷麗等[7]將梔子苷制成醇質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)它對豬鼻腔黏膜的單位面積滲透量是普通脂質(zhì)體的2.17倍,水溶液的11.03倍,而且基本無鼻黏膜纖毛毒性。二元醇質(zhì)體是用混合醇(乙醇、丙二醇)替換醇質(zhì)體中的乙醇,與普通醇質(zhì)體比較可減少了乙醇用量,防止藥物泄露,避免醇質(zhì)體的聚集,增加制劑穩(wěn)定性,降低對皮膚(黏膜)刺激性,在一定程度上也增加了藥物透皮(黏膜)吸收效果[8-10]。本實驗在前期報道的基礎(chǔ)上,制備石杉堿甲二元醇質(zhì)體溫敏凝膠及石杉堿甲溫敏凝膠,對其大鼠鼻腔給藥藥動學(xué)及腦靶向性進(jìn)行初步研究,評價二元醇質(zhì)體技術(shù)對該成分鼻腔給藥生物利用度及腦靶向性的影響,以期為該劑型今后開發(fā)利用提供實驗數(shù)據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器 ACQUITY UPLC?TOD system超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC?BEH C18超高效液相色譜柱(美國Waters公司);MPLR-702恒溫磁力攪拌器(常州市金壇大地自動化儀器廠);BT100-1F蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司);FA2004N電子天平(萬分之一,上海精密科學(xué)儀器有限公司);XS205電子天平[十萬分之一,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];Centrifuge 5418高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);VXH-3微型渦旋混合器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);HAC-20-034濃縮氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

    1.2 試劑與藥物 石杉堿甲對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號H29D8J51963,純度≥98%);石杉堿甲原料藥(西安普萊特生物工程有限公司,批號HA20191102,純度99%)。大豆卵磷脂[艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司,批號SY-SI-190602];吐溫-80(上海源葉生物科技有限公司,批號Z17D9Y77731);泊洛沙姆407(批號GNC21922B)、泊洛沙姆188(批號GNC10821B)(德國BASF公司)。石杉堿甲注射劑(海南靈康制藥有限公司,批號200601102);苯海拉明對照品(上海至吉生化科技有限公司,批號B111310D5);烏拉坦(合肥巴斯夫生物科技有限公司,批號BSF200509)。乙酸乙酯(分析純,四川西隴科學(xué)有限公司);生理鹽水(江西科倫藥業(yè)有限公司,批號B20050701);甲酸、水、甲醇(色譜純,德國Merck公司)。

    1.3 動物 SD大鼠,清潔級,雄性,體質(zhì)量(200±20)g,購于吳氏實驗動物貿(mào)易有限公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(閔)2016-0002,飼養(yǎng)條件為溫度(22±2)℃、相對濕度(50±5)%,保持室內(nèi)自然通風(fēng),自由飲食進(jìn)水,實驗前在上述環(huán)境下適應(yīng)7 d。清潔級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 石杉堿甲二元醇質(zhì)體溫敏凝膠制備 量取22.5 mL二元醇相(乙醇-丙二醇=1∶1),置于錐形瓶中,加入50 mg石杉堿甲、1.8 g大豆卵磷脂、0.15 g聚山梨酯-80,密閉攪拌20 min至完全溶解,在溫度30 ℃、攪拌速度700 r/min條件下,將27.5 mL超純水以1 mL/min速度緩慢加到二元醇相中,持續(xù)攪拌90 min至室溫,得到二元醇質(zhì)體[平均包封率為(94.05±0.22)%,平均粒徑為(260.1±5.7)nm,Zeta電位為(-20.9±0.3)mV]。稱取11.5 g P-407、2.5 g P-188,置于燒杯中,加入50 mL純化水使其完全潤濕,置于4 ℃冰箱中,得到澄清、無團(tuán)塊、分散均勻的空白溫敏凝膠溶液,將其置于燒杯中,放入冰水浴,加入等量二元醇質(zhì)體,攪拌20 min即得,在4 ℃下保存。同法制備石杉堿甲溫敏凝膠(不加二元醇質(zhì)體,改加石杉堿甲溶液)。該制劑外觀為乳白色黏稠液體,具有一定流動性;當(dāng)升溫至膠凝溫度時,二元醇質(zhì)體溫敏凝膠發(fā)生膠凝,呈凝膠狀,不具有流動性,pH值為7.01±0.04,少量2%磷鎢酸負(fù)染后在透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài),見圖1,可知其形態(tài)規(guī)整,呈球形或類球形。

    圖1 石杉堿甲二元醇質(zhì)體溫敏凝膠透射電鏡圖(×50 000)Fig.1 Transmission electron microscopic image for ther-mosensitive gel binary ethosomes of huperzine A(×50 000)

    2.2 UPLC-MS/MS測定大鼠血漿及腦組織中石杉堿甲含量 參考文獻(xiàn)[11-13]報道。

    2.2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相水(含0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脫(0~1.5 min,52∶48;1.5~3.0 min,52∶48~25∶75;3.0~3.1 min,25∶75~52∶48;3.1~5.0 min,52∶48);體積流量0.3 mL/min;柱溫45 ℃;進(jìn)樣量2 μL。

    2.2.2 質(zhì)譜條件 離子模式ESI+;掃描模式MRM;離子源溫度150 ℃;去溶劑溫度500 ℃;錐孔氣體積流量150 L/h;去溶劑氣體積流量800 L/h;碰撞氣體積流量0.25 mL/min;石杉堿甲m/z243.33~134.15,內(nèi)標(biāo)(苯海拉明)m/z256.17~167.20;錐孔電壓石杉堿甲30 V,內(nèi)標(biāo)30 V;碰撞能量石杉堿甲25 V,內(nèi)標(biāo)18 V。

    2.2.3 空白血漿、腦組織溶液制備 大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射20%烏拉坦(0.7 mL/100 g)麻醉,腹主動脈取血,置于肝素鈉抗凝的EP管中,4 000 r/min離心15 min后分離得到血漿,在-20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩H⊙蟠笫罅⒓刺幩?,斷頭,剪開頭蓋骨,取出腦組織,去除血管,吸干表面血液并用生理鹽水沖洗,精密稱定質(zhì)量后置于勻漿器中,加入生理鹽水(2 mL/g)勻漿5 min,4 000 r/min離心15 min,取上清液,在-20 ℃下冷凍保存。

    2.2.4 對照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取石杉堿甲對照品、內(nèi)標(biāo)適量,置于50 mL量瓶中,50%甲醇溶解稀釋,即得(質(zhì)量濃度分別為46、50 μg/mL),置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.5 樣品前處理

    2.2.5.1 血漿 取大鼠血漿100 μL,精密加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液,混勻,加入3 mL乙酸乙酯,渦旋混合2 min,4 000 r/min離心15 min,取上層有機(jī)相至另一試管中,40 ℃氮氣吹干,殘留物加入100 μL 50%甲醇復(fù)溶,渦旋混合,14 000 r/min離心10 min,取上清液,即得。

    2.2.5.2 腦組織 取大鼠腦組織上清液100 μL,精密加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液,混勻,加入3 mL乙酸乙酯,渦旋混合2 min,4 000 r/min離心15 min,取上層有機(jī)相至另一試管中,40 ℃氮氣吹干,殘留物加入100 μL 50%甲醇復(fù)溶,渦旋混合,14 000 r/min離心10 min,取上清液,即得。

    2.2.6 專屬性試驗 取空白血漿或腦組織、空白血漿或腦組織+對照品+內(nèi)標(biāo)、給藥后血漿或腦組織+內(nèi)標(biāo)適量,按“2.2.5”項下方法處理,在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定,結(jié)果見圖2。由此可知,空白血漿、腦組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定,表明該方法專屬性良好。

    1.石杉堿甲 2.內(nèi)標(biāo)(苯海拉明)1.huperzine A 2.internal standard (diphenhydramine)圖2 石杉堿甲MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of huperzine A

    2.2.7 線性關(guān)系考察 精密吸取石杉堿甲對照品溶液適量,50%甲醇稀釋至0.023、0.575、5.75、23、69、138、230、253 ng/mL,分別精密吸取100 μL至EP管中,氮氣吹干,加入500 μL空白血漿或腦組織,按“2.2.5”項下方法處理,在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定。以石杉堿甲質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),石杉堿甲、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,得石杉堿甲在大鼠血漿、腦組織中的方程分別為Y=0.008 8X+0.014(R2=0.999 4)、Y=0.009 2X-0.045 2(R2=0.997 8),分別在0.023~253、0.023~230 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,定量限為0.023 ng/mL。

    2.2.8 精密度試驗 精密吸取“2.2.7”項下5.75、23、69 ng/mL對照品溶液各5份,每份100 μL,置于EP管中,氮氣吹干,加入500 μL大鼠空白血漿或腦組織混勻,按“2.2.5”項下方法處理,同一天在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定6次,測得日內(nèi)精密度RSD分別為1.56%~3.04%、2.03%~3.53%;連續(xù)5 d,測得日間精密度RSD分別為2.57%~4.08%、2.57%~5.24%,符合生物樣品測定要求。

    2.2.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.7”項下5.75、23、69 ng/mL對照品溶液各100 μL,置于EP管中,氮氣吹干,加入500 μL大鼠空白血漿或腦組織混勻,室溫放置24 h,分別在-20 ℃冰箱中放置7 d、1周內(nèi)反復(fù)凍融3次,按“2.2.5”項下方法處理,在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果,血漿、腦組織在不同條件下石杉堿甲含量RSD分別小于5.0%、6.0%,表明血漿、腦組織樣品穩(wěn)定性良好。

    2.2.10 方法回收率試驗 精密吸取“2.2.7”項下5.75、23、69 ng/mL對照品溶液各5份,每份100 μL,置于EP管中,氮氣吹干,加入500 μL大鼠空白血漿或腦組織混勻,按“2.2.5”項下方法處理,在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定,測得實測濃度,計算方法回收率。結(jié)果,血漿方法回收率分別為98.43%、93.42%、93.43%,RSD分別為12.83%、4.75%、1.82%;腦組織方法回收率分別為100.13%、109.13%、96.58%,RSD分別為6.07%、4.64%、2.14%,均符合相關(guān)要求。

    2.2.11 提取回收率試驗 精密吸取“2.2.7”項下5.75、23、69 ng/mL對照品溶液各5份,每份100 μL,置于EP管中,氮氣吹干,加入500 μL大鼠空白血漿或腦組織混勻,按“2.2.5”項下方法處理,在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定,計算石杉堿甲、內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ);以甲醇代替空白血漿或腦組織,同法制備質(zhì)量濃度相同的對照品溶液,按“2.2.5”項下方法處理,在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定,計算石杉堿甲、內(nèi)標(biāo)峰面積比值B,計算提取回收率,公式為提取回收率=(A/B)×100%。結(jié)果,血漿提取回收率分別為95.88%、92.20%、90.86%,RSD分別為4.63%、0.37%、4.04%;腦組織提取回收率分別為98.23%、108.10%、93.94%,RSD分別為2.18%、8.40%、2.24%,均符合相關(guān)要求。

    2.2.12 基質(zhì)效應(yīng) 精密吸取“2.2.7”項下5.75、23、69 ng/mL對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各5份,每份100 μL,按“2.2.5”項下方法處理,在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定,計算石杉堿甲含量C;取大鼠空白血漿或腦組織100 μL,按“2.2.5”項下方法處理,將上述質(zhì)量濃度的對照品、內(nèi)標(biāo)溶液加到處理好的上清液中,40 ℃氮氣吹干,殘留物加入100 μL 50%甲醇復(fù)溶,渦旋混合,14 000 r/min離心5 min,取20 μL上清液,在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定,計算石杉堿甲含量D,計算基質(zhì)效應(yīng),公式為基質(zhì)效應(yīng)=(D/C)×100%。結(jié)果,基質(zhì)效應(yīng)為90.92%~102.17%。

    2.3 鼻腔給藥藥動學(xué)與腦靶向性研究

    2.3.1 分組、給藥與采血 155只大鼠隨機(jī)分為3組,其中鼻腔給藥組(二元醇質(zhì)體溫敏凝膠、溫敏凝膠)各50只,靜脈給藥組(石杉堿甲注射劑)55只,給藥前12 h禁食不禁水。

    鼻腔給藥組大鼠腹腔注射20%烏拉坦(0.7 mL/100 g)麻醉,仰臥,固定頭部和四肢,打開頸部,暴露食管,結(jié)扎食道以防止藥液流失,采用平頭微量注射器分別鼻腔給藥二元醇質(zhì)體溫敏凝膠、溫敏凝膠各60 μL(含石杉堿甲30 μg),給藥后立即捏住鼻子以確保溫敏凝膠快速膠凝,于給藥后5、15、30、45 min及1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h,按“2.2.3”項下方法采集血漿、腦組織,按“2.2.5”項下方法處理,待測。

    靜脈給藥組大鼠腹腔注射20%烏拉坦(0.7 mL/100 g)麻醉后,尾靜脈注射石杉堿甲注射劑(200 μg/mL)0.15 mL,于給藥后2、5、15、30、45 min及1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h,按“2.2.3”項下方法采集血漿、腦組織,按“2.2.5”項下方法處理。

    3 結(jié)果

    大鼠血漿、腦組織中石杉堿甲濃度-時間曲線分別見圖3~4,主要藥動學(xué)參數(shù)見表1,腦靶向性評價結(jié)果見表2。由此可知,二元醇質(zhì)體溫敏凝膠鼻腔給藥后腦組織AUC0~t分別是溫敏凝膠鼻腔、靜脈給藥的1.36、1.24倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),其DTE、DTP分別比后者高24.45%、16.77%,其中前者為133.58%,即具有一定的腦靶向性。

    圖3 大鼠血漿中石杉堿甲濃度-時間曲線(n=5)Fig.3 Concentration-time curves for huperzine A in rat plasma(n=5)

    圖4 大鼠腦組織中石杉堿甲濃度-時間曲線(n=5)Fig.4 Concentration-time curves for huperzine A in rat brain tissue(n=5)

    表1 石杉堿甲主要藥動學(xué)參數(shù)

    表2 石杉堿甲腦靶向性評價結(jié)果

    4 討論

    通過比較鼻腔給藥與靜脈給藥的AUCbrain/AUCplasma值可初步判斷藥物腦靶向性[16],如果無鼻-腦通路,則前者該數(shù)值應(yīng)小于后者,本實驗發(fā)現(xiàn),石杉堿甲二元醇質(zhì)體溫敏凝膠及其溫敏凝膠藥物鼻腔給藥后該數(shù)值分別為1.14、0.93,均大于靜脈給藥的0.85,表示藥物經(jīng)鼻腔給藥具有一定腦靶向性;石杉堿甲二元醇質(zhì)體溫敏凝膠鼻腔給藥在腦組織中的AUC0~t、MRT0~t顯著高于其溫敏凝膠鼻腔給藥、注射劑靜脈給藥,表明其平均滯留時間更長;石杉堿甲二元醇質(zhì)體溫敏凝膠鼻腔給藥后DTE、DTP均大于其溫敏凝膠,表明該劑型可增加經(jīng)鼻給藥腦靶向性,但程度并不明顯。文獻(xiàn)[17]報道,石杉堿甲脂溶性(表觀油/水分配系數(shù))取決于介質(zhì)的pH,在pH≥6.5時較強(qiáng),由于溫敏凝膠pH為7.0,故在鼻腔環(huán)境條件下該成分具有較強(qiáng)的脂溶性,可獲得良好的鼻腔黏膜吸收,它通過鼻腔黏膜吸收進(jìn)入血液循環(huán)后,再透過血腦屏障而進(jìn)入腦組織比例較大,而通過鼻-腦通路吸收進(jìn)入腦組織的藥物所占比例則變小,可能是導(dǎo)致其DTE、DTP數(shù)值增加程度不大的原因。

    研究表明,不易吸收的藥物(如蛋白質(zhì)、多肽等)鼻腔給藥后,更易表現(xiàn)出腦靶向性[18]。本實驗雖然未設(shè)置灌胃給藥組,但文獻(xiàn)[19]報道,石杉堿甲原位凝膠鼻腔給藥后腦組織AUC0~6 h分別為同劑量靜脈注射、灌胃給藥的1.3、2.3倍,tmax較灌胃給藥明顯縮短,表明石杉堿甲鼻腔給藥的腦靶向性強(qiáng)于口服給藥。

    5 結(jié)論

    本實驗研究了石杉堿甲二元醇質(zhì)體溫敏凝膠及其溫敏凝膠經(jīng)大鼠鼻腔給藥后的體內(nèi)藥動學(xué),并對其腦靶向性進(jìn)行評價。結(jié)果表明,二元醇質(zhì)體溫敏凝膠腦靶向性效果更優(yōu),表明將石杉堿甲制成該劑型后可增加其經(jīng)鼻給藥腦靶向性。

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