基于AHP-熵權法結合星點設計-效應面試驗優(yōu)選清熱除濕止痛液提取工藝△

胡茹英，劉效栓，肖正國，李季文，李喜香，王雪梅

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的主要病理表現(xiàn)為關節(jié)滑膜的慢性炎癥，增生形成血管翳，侵犯關節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關節(jié)軟骨、骨和關節(jié)囊破壞，最終導致關節(jié)畸形和功能喪失。遺傳、環(huán)境和生活方式是RA的主要影響因素[1-2]。臨床對于RA 仍無較滿意的治療手段，目前，以甲氨蝶呤為首選策略[3]。清熱除濕止痛方由忍冬藤、絡石藤、秦艽、桑枝、防己、牛膝、地龍、木瓜、薏苡仁、槲寄生10 味中藥組成，臨床應用效果較好。因此，本實驗采用層次分析（AHP）-熵權法結合星點設計-效應面試驗，優(yōu)選出清熱除濕止痛液的最佳提取工藝，旨在將清熱除濕止痛方制備為安全有效、質量可控、使用方便的新制劑。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（1525 型泵、717 型進樣器、2487 型雙通道紫外檢測器，Waters 公司）；CPA-225D 型十萬分之一電子天平、BS224S 型萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；98-1-B 型電子恒溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；SB-3200DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ZXFD-A5140 型全自動新型鼓風干燥箱微波真空干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；HWS-24 型恒溫水浴鍋（上海齊欣儀器有限責任公司）。

1.2 試藥

對照品綠原酸（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y22M8K36544，純度≥98%）；龍膽苦苷（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，批號：190513，純度≥98%）；絡石苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：111858-201603，純度≥99.5%）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為娃哈哈礦泉水。

絡石藤（批號：171102）、槲寄生（批號：1903040）、秦艽（批號：180902）、薏苡仁（批號：181125）、防己（批號：180801）、木瓜（批號：1712001）、牛膝（批號：180819）、忍冬藤（批號：190202）、桑枝（批號：180301）、地龍（批號：2018001）均購于甘肅省康樂中藥飲片有限責任公司，經甘肅省中醫(yī)院李喜香主任藥師鑒定均符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版要求。

2 方法與結果

2.1 提取液的制備

按原處方比例稱取忍冬藤、絡石藤、秦艽、桑枝、防己、牛膝、地龍、木瓜、薏苡仁、槲寄生10味中藥，共65 g，混勻后，按一定料液比加水浸泡，首次煎煮前補足飲片吸水量，煎煮3 次，濾過。合并濾液，濃縮至65 mL，即得清熱除濕止痛液水提液，冷藏備用。

2.2 高效液相色譜法（HPLC）測定含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry Shieid?RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.25%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，6%～10%A；10～30 min，10%A；30～35 min，10%～23%A；35～50 min，23%A；50～55 min，23%～6%A）；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：室溫；檢測波長：280 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷對照品適量，分別置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，制成質量濃度分別為1.26、1.03、1.17 mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密吸取上述各儲備液0.485、2.500、1.000 mL至5 mL棕色量瓶中，配制成分別含綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷0.122、0.515、0.234 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取2.1 項下清熱除濕止痛液水提液樣品5 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，分次加入甲醇，超聲溶解，并轉移至10 mL 量瓶中，定容至刻度，搖勻，靜置，移取適量上清液稀釋4 倍，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。按照2.2.1項下色譜條件進樣測定，見圖1。

圖1 清熱除濕止痛液中3個指標成分混合對照品溶液及供試品溶液的HPLC圖

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系 精密吸取2.2.2 項下的混合對照品溶液適量，分別進樣2、4、6、10、12、16 μL，記錄峰面積，計算線性回歸方程，結果見表1。

表1 清熱除濕止痛液中3個指標成分的線性回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍

2.2.4.2 精密度試驗 精密吸取2.2.2 項下的混合對照品溶液10 μL，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。測得綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷峰面積RSD 分別為1.227%、0.631%、0.690%，3 種成分的峰面積RSD 均小于3%，表明儀器具有良好的精密度。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于配制后的0、2、4、8、12、24 h 進樣10 μL測定，記錄綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷的峰面積，結果綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷峰面積RSD 分別為0.83%、0.45%、1.00%，3 種成分的峰面積RSD 均小于3%，表示供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.4.4 重復性試驗 按2.2.3 項下方法制備供試品溶液6 份，精密吸取10 μL，并按照2.2.1 項下色譜條件進行檢測，綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷3 種成分含量的RSD 分別為0.87%、1.79%、0.92%，均小于3%，表明此方法的重復性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 取同一批已測定各成分含量的清熱除濕止痛液提取液6 份，每份精密稱定5 mL，分別加入已知含量的對照品溶液，按2.2.3項下方法制備供試品溶液。再按2.2.1 項下色譜條件進行檢測，所得結果為綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷的平均回收率分別為97.61%、101.40%、98.25%，RSD 分別為0.12%、0.02%、0.05%，加樣回收率符合要求。

2.3 干膏得率的測定

精密量取2.1 項下濃縮液5 mL，置已干燥至質量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，按照《中國藥典》2020 年版（四部）通則0831 測定，按公式（1）計算干膏得率。

2.4 星點設計-響應面試驗

2.4.1 熵權法計算權重 信息熵法是將每個評價指標作為1 個隨機變量，計算該指標的熵權系數(shù)，其取值變異程度越大、越無序，提供的信息量越多，該指標就越重要；反之，該指標就越不重要[4-9]。用熵權法確定權重的計算步驟如下。

1）原始數(shù)據(jù)矩陣歸一化，建立原始評價指標矩陣。設m個評價指標，n個評價對象的原始數(shù)據(jù)矩陣為A=（aij）mn，對其歸一化后得到R=（Xij）mn，對大者為優(yōu)的指標而言，按照公式（2）歸一化。

式中，Xij表示i次試驗時第j個評價指標的取值，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n。

2）將原始數(shù)據(jù)陣（Xij）mn轉換為概率矩陣（Pij）mn；在信息熵公式中Pi為某個信息的概率，滿足0≤Pi≤1，必須先對矩陣（Xij）mn做歸一化處理，經處理后的矩陣可視為指標的概率矩陣。其中Pij表示第j次試驗在第i個評價指標下的概率。

3）計算指標的熵值，確定第i個評價指標的信息熵（Hi）。

4）計算指標的熵權系數(shù)（Wj）。

由公式（5）可知，當信息熵值越小，熵權系數(shù)越大，即當Xij值相差越大，表明該指標傳遞的信息量越多，作用越大，其權重值越大。結果見表2。

表2 清熱除濕止痛液中3個指標成分及干膏得率權重系數(shù)

2.4.2 AHP 法計算權重 AHP 法又名層次分析法，是主觀確定權重的方法。依據(jù)經驗判斷并比較各指標的先后順序，進而構造判斷矩陣，建立層次結構模型，再用軟件計算各指標權重[10-14]。根據(jù)提取液中各指標成分的含量，本實驗將綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷及干膏得率的優(yōu)先順序作為權重指標予以量化，構建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣。各指標的優(yōu)先順序為龍膽苦苷＞綠原酸＞絡石苷＞干膏得率，并賦予各項指標相對評分。各項指標經層次分析后得到的權重系數(shù)結果見表3。

表3 清熱除濕止痛液中3個指標成分及干膏得率成對比較的判斷優(yōu)先矩陣

根據(jù)測定結果，運用yaahp 軟件處理得到龍膽苦苷含量、綠原酸含量、絡石苷含量、干膏得率4項指標權重系數(shù)分別為0.585 2、0.225 8、0.110 6、0.078 4，根據(jù)公式CR=CI/RI（RI：隨機一致性指標），CR=0.059 2＜0.1，即指標優(yōu)先比較判斷矩陣具有良好的一致性，權重系數(shù)有效。

2.4.3 AHP-熵權法計算復合權重 通過熵權法和AHP法[17-19]分別計算得到綠原酸、龍膽苦苷、絡石苷及干膏得率的復合權重，按公式（6）計算4種指標的復合權重（ωj）分別為0.16、0.76、0.05、0.03。

2.5 星點設計-效應面法優(yōu)選清熱除濕止痛液提取工藝

2.5.1 星點-效應面設計方案及結果 對提取時間（A）、加水量（B）、浸泡時間（C）及提取次數(shù)進行單因素試驗考察，確定提取數(shù)為3 次，其次結合相關文獻報道[15-22]，確定提取時間30～150 min，加水量4～12 倍，浸泡時間15～60 min。分別按處方量稱取中藥65 g，置于圓底燒瓶中，量取適量蒸餾水進行浸泡，按表4中參數(shù)進行提取。按2.2.1項下色譜條件測定3 種成分的含量，按公式（7）計算4 種指標質量分數(shù)綜合評分值（Yj），即因變量。試驗設計及結果見表4。

表4 清熱除濕止痛液提取工藝星點設計-效應面法試驗方案及結果

2.5.2 數(shù)據(jù)處理與分析 運用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表4中的數(shù)據(jù)進行2次多元回歸擬合分析（表5），得到提取時間、加水量、浸泡時間與綜合評分之間的2 次多元回歸模型方程：Y=85.98-2.83A+4.50B-4.63C+0.57AB+4.63AC+1.96BC-7.99A2-1.83B2-4.22C2。由方差分析可知，以綜合評分為響應值時P＜0.05，表明此回歸方程顯著，而失擬項P=0.327 5，不顯著，表示未知因素對實驗干擾性小。由F值大小看出，各因素對提取工藝影響的主次順序為C＞B＞A。利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件得到二次回歸方程等高線及響應曲面圖，評價試驗因素之間的交互強度，來確定最佳提取工藝參數(shù)。等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱，越趨向橢圓表示交互作用越強，越趨向圓形則交互作用越弱，結果見圖2。根據(jù)模型擬合結果，預測最優(yōu)提取工藝為提取105 min，浸泡52.5 min，加水量9倍，綜合評分84.10。

圖2 各影響因素間的交互作用對清熱除濕止痛液提取率的響應面圖及等高線圖

表5 清熱除濕止痛液提取工藝星點設計-效應面法試驗回歸模型方差分析結果

2.6 提取工藝驗證實驗

根據(jù)軟件擬合的最優(yōu)提取工藝條件進行驗證實驗，按處方量稱取中藥65 g，平行3 份，置于圓底燒瓶中，按優(yōu)選的最優(yōu)工藝參數(shù)進行提取，考慮到實際操作情況，將預測的最優(yōu)工藝參數(shù)微調為煎煮105 min，浸泡53 min，加9 倍量的水下于回流提取裝置中提取，結果見表6。驗證值與預測值之間的RSD 為1.33%，模型預測性好，說明星點設計-效應面法適用于清熱除濕止痛液的提取工藝優(yōu)化，其建立的提取工藝穩(wěn)定、重復性較好、可操作性強，具一定的實際應用價值。

表6 清熱除濕止痛液的提取工藝驗證實驗結果

3 討論

3.1 溶劑的選擇

因提取液中龍膽苦苷含量較高，綠原酸及絡石苷含量較低，故為了使其平衡，采用70%乙醇、無水乙醇溶解樣品，發(fā)現(xiàn)含乙醇樣品色譜圖雜質較多；經正丁醇萃取結果發(fā)現(xiàn)，綠原酸的含量并未因富集而大幅增加，龍膽苦苷及絡石苷的含量變化不明顯；加少量酸溶液龍膽苦苷溶解效果也一般。最終經比較選擇用甲醇超聲溶解處理的樣品，較其他方法綠原酸、龍膽苦苷及絡石苷各指標成分含量均較高，色譜圖峰形好且分離度較佳。

3.2 檢測波長的選擇

經全波長掃描，分別比較254、270、300、320 nm等波長下色譜圖，發(fā)現(xiàn)在254 nm 附近龍膽苦苷吸收較好，絡石苷峰太低，在320 nm 附近綠原酸吸收較好，龍膽苦苷色譜峰吸收不明顯，最終選擇280 nm。

3.3 流動相選擇

實驗過程中分別以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等流動相進行洗脫，發(fā)現(xiàn)色譜峰出現(xiàn)分離不好、拖尾等現(xiàn)象，經比較發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.25%磷酸水溶液梯度洗脫，色譜峰較好。