扶金化積丸對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及機(jī)制

夏小軍， 雷旭東， 段 赟， 陳浩方， 郭炳濤， 馬 駿， 趙文秀， 李文基

(1.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730050)

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，全球每年大約有100萬(wàn)人死于該病[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌病例的85%，有70%患者表現(xiàn)為局部晚期或轉(zhuǎn)移[2]。在過(guò)去幾十年里，雖然手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)手段不斷取得進(jìn)展，但其不良反應(yīng)和耐藥性是降低肺癌患者生存質(zhì)量和存活率的主要原因，已成為相關(guān)治療的瓶頸[3-4]。

腫瘤負(fù)荷、侵襲、轉(zhuǎn)移是肺癌治療失敗和預(yù)后不良的主要影響因素[5]，故需要開(kāi)發(fā)高效、低毒、多靶點(diǎn)的新型藥物。中醫(yī)藥具有來(lái)源廣、成本低、不良反應(yīng)少、靶點(diǎn)多等諸多優(yōu)勢(shì)，而且與傳統(tǒng)放化療相比在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面具有優(yōu)勢(shì)[6]。本研究探討扶金化積丸對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)、臟器指數(shù)、機(jī)體免疫、NF-κB、MMP-9蛋白表達(dá)的影響，以期為相關(guān)臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物及瘤株 C57BL/6小鼠48只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(甘)2015-0001，合格證號(hào)0000952。Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。

1.2 試劑與藥物 扶金化積丸由甘肅省腫瘤醫(yī)院提供，批號(hào)20190325；貞芪扶正顆粒(甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司，批號(hào)Z62020415)。RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)AE24464298)；0.25%胰蛋白酶(上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)T3926890)；胎牛血清(美國(guó)Life Technologies Corporation公司，批號(hào)42G327016)；小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-2試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)1906M)；中性樹(shù)膠、蘇木素(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G8590、G1080)；MMP-9抗體(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)0066523)；NF-κB抗體(美國(guó)Gene Tex公司，批號(hào)41556)。

1.3 儀器 全自動(dòng)血液分析儀(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)；包埋機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；電子天平(慈溪市天東衡器廠)。

2 方法

2.1 藥液配制 扶金化積丸用生理鹽水分別配制成質(zhì)量濃度為0.087 5、0.043 7、0.021 9 g/mL的藥液(即為高、中、低劑量組)，貞芪扶正顆粒用生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為0.25 g/mL的藥液。

2.2 建模、分組及給藥 將Lewis細(xì)胞株于1640培養(yǎng)基(含10% FBS、1%雙抗)中培養(yǎng)，0.25%胰酶(含EDTA、酚紅)消化，調(diào)整細(xì)胞密度約為2×106/mL。40只小鼠右腋皮下接種細(xì)胞懸液0.2 mL/只建立荷瘤模型，接種約1周后待腫瘤長(zhǎng)至0.5 cm時(shí)，將其隨機(jī)分為荷瘤對(duì)照組，陽(yáng)性組(貞芪扶正顆粒5 g/kg，相當(dāng)于臨床人用量的30倍)即扶金化積丸高、中、低劑量組(劑量分別為1.749、0.875、0.437 g/kg，分別相當(dāng)于臨床人用量的30、15、7.5倍)，每組8只，另取8只小鼠作為正常組，除正常組、荷瘤對(duì)照組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水外，其他各組小鼠均按0.02 mL/g劑量灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，共14 d。停藥1 h后，稱(chēng)定小鼠體質(zhì)量，眼球采血，再脫頸椎處死，取瘤體、胸腺、脾臟待測(cè)。

2.3 小鼠瘤質(zhì)量、瘤體體積、抑瘤率檢測(cè) 游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠瘤體長(zhǎng)、短徑，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算瘤體體積、抑瘤率，公式為瘤體體積=長(zhǎng)徑×短徑2、抑瘤率=[(荷瘤對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/荷瘤對(duì)照組平均瘤質(zhì)量]×100%。

2.4 小鼠臟器指數(shù)檢測(cè) 稱(chēng)定小鼠胸腺、脾臟質(zhì)量，計(jì)算器官指數(shù)，公式為器官指數(shù)=(器官濕重/體質(zhì)量)×100%。

2.5 小鼠血常規(guī)檢測(cè) 采用全自動(dòng)血液分析儀，檢測(cè)小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)及HGB水平。

2.6 小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平，操作嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.7 小鼠瘤組織病理學(xué)檢測(cè) 小鼠瘤組織在10%甲醛溶液中固定24 h后置于包埋盒中，流水清洗30 min，不同體積分?jǐn)?shù)(由低到高)乙醇脫水，二甲苯透明瘤組織，浸蠟包埋成塊，切成薄片，脫蠟水化，HE染色，中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察。

2.8 小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9表達(dá)檢測(cè) 取小鼠瘤組織適量，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，自來(lái)水沖洗，檸檬酸鈉加熱修復(fù)抗原，3%H2O2孵育封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS漂洗，一抗(1∶200)、二抗依次孵育，PBS漂洗后，DAB(1∶20)顯色，當(dāng)呈現(xiàn)棕黃色時(shí)終止顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染約1 min，不同體積分?jǐn)?shù)(由低到高)乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下拍照。采用圖像分析軟件，對(duì)瘤體中NF-κB、MMP-9表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 扶金化積丸對(duì)小鼠瘤質(zhì)量、瘤體體積、抑瘤率的影響 如表1所示，扶金化積丸高、中劑量組及貞芪扶正顆粒組小鼠瘤質(zhì)量、瘤體體積均小于荷瘤對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。

表1 扶金化積丸對(duì)小鼠瘤質(zhì)量、瘤體體積、抑瘤率的影響

3.2 扶金化積丸對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 如表2所示，扶金化積丸高劑量組及貞芪扶正顆粒組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)均高于荷瘤對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)；與扶金化積丸高劑量組比較，扶金化積丸低劑量組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)均降低(P<0.05，P<0.01)。

表2 扶金化積丸對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

3.3 扶金化積丸對(duì)小鼠血常規(guī)的影響 如表3所示，荷瘤對(duì)照組小鼠RBC、PLT、WBC數(shù)量及HGB水平均低于正常組(P<0.01)；與荷瘤對(duì)照組比較，扶金化積丸高、中劑量組及貞芪扶正顆粒組小鼠RBC、WBC、PLT數(shù)量及HGB水平均升高(P<0.05，P<0.01)，而扶金化積丸低劑量組上述指標(biāo)無(wú)明顯變化(P>0.05)。

3.4 扶金化積丸對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平的影響 如表4所示，與荷瘤對(duì)照組比較，扶金化積丸高劑量組及貞芪扶正顆粒組小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平均升高(P<0.05，P<0.01)，扶金化積丸中劑量組IFN-γ水平升高(P<0.05)。

表3 扶金化積丸對(duì)小鼠血常規(guī)的影響

3.5 扶金化積丸對(duì)小鼠瘤組織形態(tài)的影響 如圖1所示，荷瘤對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，核固縮罕見(jiàn)，偶見(jiàn)局灶性壞死，瘤組織血供充盈；貞芪扶正顆粒組瘤細(xì)胞呈條索狀分布，出現(xiàn)瘤組織不同程度壞死、病理性核碎裂，瘤組織內(nèi)及其周?chē)┹^少，核固縮較多，胞漿顏色較深；扶金化積丸各劑量組隨著劑量增加，壞死區(qū)域逐漸增大，低劑量組有少量出血，而高劑量組有明顯壞死及出血情況，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。

3.6 扶金化積丸對(duì)小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9表達(dá)的影響 如圖2～3、表5所示，荷瘤對(duì)照組小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9呈高表達(dá)；與荷瘤對(duì)照組比較，扶金化積丸高劑量組、貞芪扶正顆粒組小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9表達(dá)均降低(P<0.01)，中劑量組MMP-9表達(dá)降低(P<0.05)。

表4 扶金化積丸對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平的影響

圖1 各組小鼠瘤組織形態(tài)(×200)Fig.1 Morphologies of mouse tumor tissues in various groups (×200)

4 討論

中醫(yī)藥作為補(bǔ)充替代治療的重要組成部分，由于其不良反應(yīng)小、成本低、臨床療效好，常被用于肺癌的維持治療[7]，中藥復(fù)方治療是其最重要的特點(diǎn)特點(diǎn)之一[8]。肺癌是一種與身體狀態(tài)有關(guān)的全身性疾病，治療策略強(qiáng)調(diào)通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)系統(tǒng)性調(diào)整，改善全身而產(chǎn)生治療效果，而不是單純的清除腫瘤或殺死癌細(xì)胞[9]。本研究結(jié)果顯示，扶金化積丸可有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，具有很好的抗癌效果。

表5 扶金化積丸對(duì)小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9表達(dá)的影響

扶金化積丸是甘肅省腫瘤醫(yī)院根據(jù)中醫(yī)辨證施治理論研制出的純中藥制劑，用于肺癌的臨床治療，考慮到肺癌患者肺氣不足、正氣虧虛的特點(diǎn)，將一部分飲片提取濃縮，另一部分粉碎成細(xì)粉，以適量水為為黏合劑，制成濃縮丸。方中君藥西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津；臣藥黃芪補(bǔ)氣固表，岷當(dāng)歸補(bǔ)血止血，雞血藤行血補(bǔ)血，生脈散(《內(nèi)外傷辨惑論》[10])、百合養(yǎng)陰潤(rùn)肺、生津止咳，二至丸(《醫(yī)便》[11])、山萸肉補(bǔ)益肝腎、滋陰止血；佐藥消瘰丸(《中醫(yī)方劑臨床手冊(cè)》[12])清熱化痰、軟堅(jiān)散結(jié)，龍葵散瘀消腫、清熱解毒，莪術(shù)、川芎活血行氣止痛；使藥薏苡仁滲濕健脾，山楂散瘀化積、助運(yùn)脾胃，諸藥合用，對(duì)因痰、瘀、毒而致氣陰兩虛的肺積，可共奏益氣養(yǎng)陰、扶正祛邪之功效。

研究表明，中藥主要是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用[6]；本研究結(jié)果顯示，扶金化積丸的抗肺癌活性可能與增強(qiáng)免疫器官功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。血清細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)宿主防御中起著重要作用，IL-2能促進(jìn)應(yīng)答性T細(xì)胞的增殖，IFN-γ在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[13-14]。海參提取物被報(bào)道可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ誘導(dǎo)有效的宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)[15]；本研究結(jié)果顯示，扶金化積丸處理可有效上調(diào)小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平，增強(qiáng)免疫防御功能。

NF-κB是一種調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、病毒復(fù)制和各種自身免疫性疾病過(guò)程等[16]，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中可通過(guò)上調(diào)其表達(dá)來(lái)參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和抑制凋亡的基因促進(jìn)腫瘤進(jìn)程[17]。目前，用于肺癌治療的NF-κB抑制劑正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，并取得良好的療效[18]。在NSCLC中，MMP-9活性與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，此外Meta分析顯示其過(guò)表達(dá)是腫瘤分期及不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素之一[19]。本研究結(jié)果表明，扶金化積丸可有效抑制瘤組織NF-κB和MMP-9的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，可為探討該制劑對(duì)肺癌的潛在治療作用提供科學(xué)依據(jù)。