葛根芩連湯對KKAy 糖尿病小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

王 芬，吳麗麗，焦婷婷，何華亮

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.武警北京總隊醫(yī)院，北京 100027）

葛根芩連湯出自《傷寒雜病論》太陽病篇，是治療濕熱證的急性腹瀉的經(jīng)典代表方劑。方中由葛根、黃芩、黃連、甘草4 味藥組成。原文記載“太陽病，桂枝證醫(yī)反下之，利遂不止。脈促者，表未解也；喘而汗出者，葛根黃連黃芩湯主之”。主治太陽病邪熱內(nèi)傳、大腸傳導(dǎo)失司所致的下利。制方之理在于太陽表邪未解，邪陷陽明，大腸濕熱壅滯，里熱蒸肺迫腸，升降失調(diào)，津液外泄。近年來，經(jīng)過臨床反復(fù)驗證該方具有一定的治療糖尿病作用[1-2]，結(jié)合臨床療效及現(xiàn)代藥理[3]，對于 2 型糖尿病發(fā)病初期，因飲食不節(jié)致肺胃實熱證或濕熱內(nèi)蘊(yùn)體質(zhì)的患者，該方能夠明顯改善臨床癥狀、降低血糖水平。按《傷寒論》原文意旨，存在腸道濕熱壅滯、出現(xiàn)利遂不止癥狀，正好契合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論——腸道菌群結(jié)構(gòu)變化這一機(jī)制。故本研究立足中西互參，在共同病位及主證的基礎(chǔ)上，通過觀察葛根芩連湯對2 型糖尿病小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響以期揭示其部分降糖機(jī)理，豐富中醫(yī)臨床與實驗研究相互佐證的證據(jù)，為糖尿病防治提供新思路、新視角。

1 材料

SPF 級雄性 KKAy 小鼠65 只及C57BL 小鼠13只，均購自北京華阜康生物科技有限股份公司，[許可證號：SCXK（京）2014-0004]，10 周齡，體質(zhì)量（35.5±3.0）g。大鼠在無特定病原體（SPF 級）條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：溫度（21±2）℃，濕度（60±10）%，12 h/12 h 光照黑暗循環(huán)。該實驗已通過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所[許可證號 SYXK（京）2016-0021]動物實驗倫理會審查（編號2019-067），符合實驗動物倫理委員會相關(guān)指導(dǎo)原則。HiPure 土壤 DNA 試劑盒（或 HiPure 糞便 DNA 試劑盒）Magen，Guangzhou，China）according。葛根芩連湯配方顆粒由廣東一方制藥廠制備，由葛根、黃芩、黃連、甘草按照 8 :3 :3 :2 的比例組方。實驗前用蒸餾水配制，超聲30 min 后4 ℃保存。Agilent 2100 生物分析 儀（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）。

Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen，Carlsbad，CA）。Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）儀器。3K15 型高速低溫離心機(jī)（美國Sigma 公司），HiSeq 2500 型高通量測序儀（美國Illumina 公司），Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）儀器，T 100型梯度 PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），DL-CJ-2NDI 型超凈工作臺（中國東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，設(shè)雄性 C57BL小鼠為正常組，予普通飼料喂養(yǎng)；雄性 KKAy 小鼠給予華阜康公司生產(chǎn)的高脂飼料喂養(yǎng)2 周，隨機(jī)平均血糖≥13.9 mmol/L，為成模小鼠，共44 只。按體質(zhì)量及隨機(jī)血糖隨機(jī)分為5 組，正常組、陽性組（3.9 mg/kg）、葛根芩連湯高、低劑量組（18.2、4.55 g/kg）及模型組（生理鹽水20 mL/kg），每組11 只。給藥組均按 0.01 mL/g·d 的標(biāo)準(zhǔn)灌胃給藥1 次，正常組和模型組則予相同劑量的生理鹽水灌胃1 次，連續(xù)8 周。喂養(yǎng)過程中小鼠均自由取食、飲水。

2.2 取材及指標(biāo)檢測 喂養(yǎng)過程中，每周監(jiān)測血糖及體質(zhì)量。第8 周，末次給藥后禁食不禁水10 h，予眶靜脈取血，分離血清備用。取小鼠新鮮糞便，-80 ℃ 保存。

2.3 腸道菌群DNA 提取，PCR 擴(kuò)增及建庫 將糞便放至離心管中研磨，加入裂解液，混勻后加入Proteinase K 及溶菌酶，顛倒混勻，55 ℃孵育箱中孵育2 h 后，12 000 r/min 離心5 min，吸取上清，加入蛋白沉淀液，渦旋 10 s 后置冰上5 min，再次離心，抽取上清，加入異丙醇，混勻后冰上放置20 min。離心后倒出液體，沉淀物用 75% 乙醇1 mL 反復(fù)洗滌 2 次，離心，棄上清，白色沉淀適度干燥，加入雙蒸水50 μL，震蕩后加入 RNase A 1 μL，顛倒混勻后37 ℃ 溫育15 min。以稀釋后的基因組 DNA 為模板。

以30～50 ng DNA 為模板，使用設(shè)計的一系列 PCR 引物擴(kuò)增原核生物 16S rDNA 上包括 V3及 V4 的 2 個高度可變區(qū)。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“ GGACTACNVGGGTWTCTAATCC ”序列的下游引物擴(kuò)增 V3 和 V4 區(qū)。另外，通過PCR 向16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物末端加上帶有 Index 的接頭，以便進(jìn)行NGS 測序。使用 Agilent 2100 生物分析儀（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）檢測文庫質(zhì)量，并且通過 Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen，Carlsbad，CA）檢測文庫濃度。DNA 文庫混合后，按 Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）儀器使用說明書進(jìn)行PE 250/300 雙端測序，由MiSeq 自帶的MiSeq Control Software（MCS）讀取序列信息。

2.4 腸道菌群數(shù)據(jù)分析 雙端測序得到的正反向 reads首先進(jìn)行兩兩組裝連接，過濾拼接結(jié)果中含有N 的列，保留序列長度大于200 bp 的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于OTU 分析，使用VSEARCH（1.9.6）進(jìn)行序列聚類（序列相似性設(shè)為 97%），比對的16S rRNA 參考數(shù)據(jù)庫是 Silva 132。然后用RDP classifier（Ribosomal Database Program）貝葉斯算法對OTU 的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成?；贠TU 的分析結(jié)果，采用對樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，分別計算 Shannon、Chao1 等α 多樣性指數(shù)，并作出稀釋曲線。通過 unweighted unifrac 分析比較樣本間是否有顯著的微生物群落差異，基于Brary -Curtis 樣本間距離矩陣用于 PCoA（principal coordinates analysis）可視化圖展示β 多樣性。通過層次聚類（Hierarchical cluatering）中的非加權(quán)組平均法構(gòu)建UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）進(jìn)化樹。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；組間比較用單因素方差分析，2 組間數(shù)據(jù)比較通過 T-test 或 Wilcox 秩和檢驗或 Tukey 檢驗，用于分析組間物種多樣性差異是否顯著。

3 結(jié)果

3.1 葛根芩連湯對 KKAy小鼠體質(zhì)量的影響 見表1。

表1 治療前后 KKAy 小鼠體質(zhì)量比較（，n =10）g

表1 治療前后 KKAy 小鼠體質(zhì)量比較（，n =10）g

注：與正常組比較，## P ＜0.01，與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.2 葛根芩連湯對KKAy 小鼠血糖的影響 見表2。

表2 治療前后 KKAy 小鼠血糖比較（，n =10）mmol/L

表2 治療前后 KKAy 小鼠血糖比較（，n =10）mmol/L

注：與正常組比較，## P ＜0.01，與模型組比較，△△P ＜0.01，與陽性組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

3.3 葛根芩連湯對KKAy 小鼠腸道菌群16s rRNA 的影響 送檢50 個小鼠糞便樣本中。通過檢測16s rRNA V3，V4 區(qū)，總共獲得片段14 756 448 個，經(jīng)過裁剪與修飾后獲得7 378 224 個。其中，正常組小鼠片段954 115 個，占總量的12.93%；模型組片段960 062 個，占總量的13.01%；陽性組有1 058 427 片段，占總量的14.35%；葛根芩連湯高劑量組有732 209 片段，占總量的9.92%；葛根芩連湯低劑量組有1 042 801 片段，占總量的14.13%；小鼠片段從47 425 個到64 808 個，平均為56 416 個，平均長度為454 bp。

3.3.1 KKAy 小鼠腸道菌群操作分類單元（OTU）分析 OTU 數(shù)量表示小鼠腸道內(nèi)容物中微生物的豐度，數(shù)值越大表明微生物越豐富。通常以細(xì)菌群落豐度指數(shù)與群落多樣性指數(shù)來衡量，群落豐度指數(shù)包括Chao1 和ACE，此指數(shù)值越大說明群落的豐度越高。與正常對照組相比，模型組小鼠OTU 數(shù)量顯著下降。使用葛根芩連湯后小鼠菌群多樣性與模型比較出現(xiàn)了顯著的差異，且菌群多樣性均高于陽性對照。在菌群多樣性方面，葛根芩連湯組與正常組無顯著性差異，說明葛根芩連湯對糖尿病小鼠菌群有明顯的改善。其中不同濃度的葛根芩連湯組對OTU 數(shù)量影響不同。低劑量組有著相對較好改善菌群的效果。見表3、圖1。

表3 葛根芩連湯對KKAy 小鼠腸道菌群物種的豐度比較（，n =10）

表3 葛根芩連湯對KKAy 小鼠腸道菌群物種的豐度比較（，n =10）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05

圖1 OTU 分析結(jié)果

3.3.2 葛根芩連湯對群落多樣性指數(shù)的影響 見表4。

表4 葛根芩連湯對KKAy 小鼠菌群多樣性及均度影響（，n =10）

表4 葛根芩連湯對KKAy 小鼠菌群多樣性及均度影響（，n =10）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.3.3 菌群的群落結(jié)構(gòu) 對各組中每個樣本在門的水平上整體的群落結(jié)構(gòu)差異并不大，所有樣品均包含F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）2 個主要的門，同時還包含Proteobacteria（變形菌門）、Patescibacteria 和Actinobacteria（放線菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）。

3.3.3.1 綱結(jié)果 正常組中以Bacteroidia、Clostridia為主。不同濃度的葛根芩連湯給藥組對于菌群影響較大，高劑量組大大提升了Bacteroidia 的豐度，占比66.20%。而低劑量組只有41.61%，同時也降低了Bacilli、Clostridia（P＜0.05）豐度。葛根芩連湯組能顯著降低Bacilli 和Saccharimonadia 豐度和占比，使其更加接近于正常組，結(jié)合α 多樣性分析，可見葛根芩連湯組對恢復(fù)菌群豐度及多樣性有一定療效。模型組中幾乎消失的Verrucomicrobiae，在葛根芩連湯低劑量組中顯著提高，占比可達(dá)到2.23%，這是其他治療組中所沒有的。

3.3.3.2 屬結(jié)果 給藥后，模型組中Lactobacillus（P＜0.001）、Bacteroides（P＜0.01）、Alistipes（P＜0.01）、Streptococcus（P＜0.05）豐度顯著上升，組內(nèi)占比分別達(dá)到34.97%、10.41%、6.71%和2.38%。而Akkermansia（P＜0.001）、Allobaculum（P＜0.001）豐度顯著下降，模型組豐度幾乎為0。f__Muribaculaceae_Unclassified、Lachnospiraceae_NK4A136_group 豐度雖然下降，但并不顯著。陽性組治療后，Bacteroides（P＜0.05）豐度顯著下降，占比降低為3.77%。f__Muribaculaceae_Unclassified、Lachnosp-iraceae_NK4A136_group 和Alistipes 的 豐度雖然在一定程度的略有降低，但無顯著性差異。Akkermansia 豐度卻顯著性上升，說明陽性組主要通過調(diào)節(jié)Bacteroides 和Akkermansia 豐度來恢復(fù)菌群穩(wěn)態(tài)。

中藥組中，Bacteroides（P＜0.05）和Alistipes（P＜0.01）在葛根芩連湯低劑量組顯著降低，而Akkermansia（P＜0.05）豐度顯著升高。中藥組相較于模型組，Lactobacillus（P＜0.05）豐度顯著降低，其中低劑量組中占比降為15 %。而f__Muribaculaceae_Unclassified（P＜0.05）和Ruminococcaceae_UCG-0144 顯著上升，且f__Muribaculaceae_Unclassified 在高劑量組與正常組中無明顯差異。中藥組相較于陽性組，Lactobacillus 豐度下降，Akkermansia 和f__Muribaculaceae_Unclassified豐度占比上升，可以說明葛根芩連湯組主要通過影響菌 群Lactobacillus、Akkermansia 和f__Muribaculaceae_Unclassified 豐度來調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，其中低劑量組菌群結(jié)構(gòu)與正常組最接近。見圖2。

圖2 屬水平物種相對豐度圖

3.3.3.3 科水平 在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。差異物種Biomarker 跟隨組進(jìn)行著色，紅色節(jié)點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群。英文字母表示物種名稱。LDA 值分布柱狀圖中展示了LDA Score ＞設(shè)定值（默認(rèn)設(shè)置為2）的物種，即組間有統(tǒng)計學(xué)差異的Biomarker。展示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大?。礊長DA Score）。見圖3。

圖3 進(jìn)化分支圖

3.3.4 菌群分類 模型組主要以乳桿菌綱水平下的_Lactobacillus 乳酸菌為優(yōu)勢菌。葛根芩連湯低劑量組以梭菌目下Lachnospiraceae 毛螺菌科以及Verrucomicrobiales 疣微菌目水平下Akkermansiaceae 為優(yōu)勢菌。葛根芩連湯高劑量組優(yōu)勢菌種有Bacteroidales 擬桿菌目下普雷沃氏菌科和Proteobacteria 變形菌門下Enterobacteriales 腸桿菌目Enterobacteriaceae 腸桿菌科。見圖4。

圖4 LDA Score

3.3.5 小鼠腸道菌群主成分分析（principal component analysis，PCA）圖5 可以看出，各組分有著明顯分離，正常組與其他組明顯分離，說明菌群有著明顯的差異，除正常組和陽性組，其余組與模型組有部分重疊或者距離相近。對比給藥組，模型組經(jīng)過用藥處理后，葛根芩連湯組中，葛根芩連湯高劑量組和模型組菌群較為相似，葛根芩連湯低劑量組與模型組有顯著性差異，且該組內(nèi)樣本的菌群差異較其他組增大。

圖5 菌群主成分分析

4 討論

2 型糖尿病已經(jīng)成為全球面臨的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。近年來，據(jù)統(tǒng)計全球糖尿病的醫(yī)療成本至少是人均醫(yī)療保健支出的3.2 倍，糖尿病并發(fā)癥的醫(yī)療成本上升到9.4 倍[4]。而作為與2 型糖尿病發(fā)病主要相關(guān)的超重和肥胖的增長，已成為代謝性疾病未來趨勢的更可怕的預(yù)測的代表[5-6]。隨著糖尿病作用機(jī)理研究的不斷深入，腸道菌群已成為近年來研究的新興熱點。已證實，腸道菌群是有效調(diào)控血糖的代謝途徑之一[7-9]。諸多研究表明，中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)腸道菌群能夠抑制胰島素抵抗和2 型糖尿病炎癥反應(yīng)[10]?，F(xiàn)已證明，腸道菌群失衡是糖代謝異常的始動因素。腸道菌群紊亂，可以引起慢性炎性反應(yīng)，引起胰島素抵抗，進(jìn)而誘發(fā)2 型糖尿病的發(fā)生[11-12]。其中腸屏障功能破壞是引起代謝性內(nèi)毒素血癥的重要環(huán)節(jié)，[13]。葛根芩連湯具有明確治療2 型糖尿病肺胃實熱證及胃腸實熱證的臨床療效，故本研究立足于此探索其具體作用機(jī)理。

實驗結(jié)果表明，與正常組相比，糖尿病模型組小鼠腸道內(nèi)菌群從門水平到屬水平均發(fā)生了變化。腸道菌群中擬桿菌門和厚壁菌門的豐度與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，它們主要參與了腸道內(nèi)糖、脂的代謝等過程。本研究中，模型組及陽性組小鼠腸道菌群中厚壁菌門豐度有不同程度上升，其中模型組厚壁菌門升高源于糖尿病菌群失調(diào)，陽性組增多原因考慮可能是產(chǎn)丁酸鹽菌數(shù)量增多，例如Ruminococcus，從而達(dá)到對機(jī)體保護(hù)的作用。同時也提示，陽性藥物阿卡波糖與中藥葛根芩連湯發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的菌群是有一定區(qū)別的。這與賈強(qiáng)等研究結(jié)果相一致[14]。Ley 等分析大鼠及人群的腸道菌群基因序列發(fā)現(xiàn)，瘦鼠的擬桿菌門數(shù)量比胖鼠多 50%，厚壁菌門的數(shù)量則低于胖鼠。肥胖人群腸道內(nèi)的厚壁菌門比例高于正常人群，減肥成功后，其腸道內(nèi)的厚壁菌門比例會大幅下降[15]。揭示厚壁菌門與肥胖明顯相關(guān)。本研究動物模型為自發(fā)性2 型糖尿病模型，予高脂飼料喂養(yǎng)，提示其糖、脂代謝異常均參與了腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變。另外，與正常對照組相比，糖尿病小鼠的 Shannon 指數(shù)顯著下降，而藥物治療組則抑制了這種趨勢，其中葛根芩連湯低劑量組的OTU、ACE、chao1 與正常組并無顯著差異，提示該組在調(diào)節(jié)菌群多樣性方面效果顯著。

乳酸桿菌的比例升高，可以增加胰島素分泌，阻止病原菌對腸道的入侵和定植，抑制內(nèi)毒素的產(chǎn)生，從而維持腸道的微生態(tài)平衡。因此，增加乳酸桿菌比例被認(rèn)為是對 2 型糖尿病患者具有降低血糖的保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腸道中乳酸桿菌 豐度升高，分析可能與其抵御 2 型糖尿病小鼠體內(nèi)炎癥因子有關(guān)，此結(jié)果與吳莉娟研究的結(jié)果相一致[16]。給予葛根芩連湯干預(yù)后，腸道中乳酸桿菌豐度下降，給藥組乳酸桿菌豐度接近于正常組，說明葛根芩連湯具有一定程度緩解低度炎癥的效果，或者具有一定程度的類似于乳酸桿菌對機(jī)體的調(diào)節(jié)作用。Akkermansia 的有效性主要源于其對腸炎癥如腸炎或慢性腸易激綜合征的抑制作用，現(xiàn)研究已明確 Akkermansia 可減少對肥胖癥和糖尿病的影響。葛根芩連湯低劑量組能夠提高Akkermansia 的豐度，說明中藥可能通過改善腸道炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂代謝起到緩解 2 型糖尿病及胰島素抵抗的作用。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)的改善優(yōu)于高劑量組。

糖尿病患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與腸道非特異性炎癥有明顯相關(guān)性[18]。已證實，大量革蘭氏陰性菌死亡溶解后，釋放的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用于細(xì)胞表面 Toll 樣受體 4（TLR4），引發(fā)一系列炎癥因子，產(chǎn)生機(jī)體的低度炎癥狀態(tài)[19]，從而產(chǎn)生胰島素抵抗，并破壞胰島β細(xì)胞功能，導(dǎo)致 2型糖尿病[20]。故應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)該方面的研究。