鱉甲消癥丸對(duì)肝硬化門(mén)靜脈高壓癥大鼠肝功能及血清NO、ET-1、VEGF 的影響

吳曉玲，李力強(qiáng)，吳偉斌，胡鈺穎，楊 堅(jiān)，祝曉忠，張貴鋒*

（1.肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，廣東 肇慶 526020；2.肇慶市中醫(yī)院，廣東 肇慶 526020）

門(mén)靜脈高壓癥（portal hypertension，PHT）是由肝硬化等導(dǎo)致門(mén)靜脈壓力持久增高引起的癥候群，采取有效措施降低門(mén)靜脈壓力對(duì)延緩靜脈曲張進(jìn)展、預(yù)防食管胃底靜脈曲張破裂出血至關(guān)重要[1]。鱉甲消癥丸是一種能有效預(yù)防肝硬化食道胃底靜脈曲張破裂出血中藥院內(nèi)制劑（粵藥制字Z20070356，專(zhuān)利號(hào)ZL20150670167.3）[2]。為探索該藥物的作用靶點(diǎn)及療效機(jī)制，課題組觀(guān)察了鱉甲消癥丸對(duì)肝硬化門(mén)靜脈高壓癥大鼠的門(mén)靜脈壓力（PVP）、肝臟組織、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBil）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體2（VEGF/VEGFR2）等指標(biāo)的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

SD 大鼠40 只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組10 只、造模組30 只。造模成功后的大鼠24 只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、普萘洛爾組、鱉甲消癥丸組，每組8 只；空白對(duì)照組8 只入組觀(guān)察。鱉甲消癥丸（批號(hào)20180702，肇慶市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)），普萘洛爾片（批號(hào)B180905，江蘇亞邦藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司），高脂飼料，四氯化碳，AST、ALT、TP、ALB、TBil 檢測(cè)試劑盒，總NO 檢測(cè)試劑盒，ET-1/VEGF ELISA 試劑盒，蛋白濃度測(cè)定試劑盒，VEGFR2 和β-actin 抗體，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模 參考文獻(xiàn)采用四氯化碳復(fù)合法誘導(dǎo)造模[3]：造模組大鼠給予高脂飼料加5%食用白酒溶液進(jìn)行飼養(yǎng)，空白對(duì)照組用普通飼料及蒸餾水進(jìn)行飼養(yǎng)。第1～2 周按20 mL/kg 體質(zhì)量給予造模組40%（v/v）的四氯化碳橄欖油溶液灌胃，第3～12 周按20 mL/kg體質(zhì)量給予造模組50%（v/v）的四氯化碳橄欖油溶液灌胃，每周一、周四各給藥1 次?？瞻捉M給予等量橄欖油溶液。第12 周末，隨機(jī)選擇空白組、造模組大鼠各2只，對(duì)比空白組及造模組指標(biāo)，確定造模是否成功。

2.2 干預(yù)方法 普萘洛爾組、鱉甲消癥組分別用普萘洛爾片、鱉甲消癥丸混懸液進(jìn)行灌胃給藥。普萘洛爾10 mg/kg，鱉甲消癥丸0.5 丸/kg。用小量溫水將藥物研磨為混懸液，加入適量溫水配置為灌胃液，按照5 mL/kg 體質(zhì)量進(jìn)行灌胃?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。每日干預(yù)1 次，連續(xù)干預(yù)8 周。

2.3 體質(zhì)量檢測(cè)及癥狀觀(guān)察 將大鼠置于1 L燒杯內(nèi)，待大鼠安定后讀取電子天平測(cè)量值，減去燒杯質(zhì)量。每日觀(guān)察記錄1次大鼠的進(jìn)食、毛發(fā)色澤、活動(dòng)狀態(tài)等。

2.4 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 門(mén)靜脈壓力檢測(cè)，大鼠禁飲食8 h，烏拉坦麻醉后切開(kāi)腹部暴露門(mén)靜脈主干，用PE-50 導(dǎo)管穿刺門(mén)靜脈主干，接通壓力傳感器及多通路記錄儀，取3 次平均值。通過(guò)HE 染色及Masson 染色觀(guān)察大鼠肝組織損傷情況及纖維化程度。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，檢測(cè)肝功能指標(biāo)及血清NO、ET-1、VEGF。運(yùn)用蛋白印跡法檢測(cè)VEGFR2 蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，圖像采用imageJ 進(jìn)行半定量分析，運(yùn)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用one-ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量結(jié)果的比較 模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量升高到第4周開(kāi)始逐漸下降，空白對(duì)照組、普萘洛爾組、鱉甲消癥丸組體質(zhì)量持續(xù)上升，普萘洛爾組的大鼠體質(zhì)量升高最為顯著。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 連續(xù)給藥8 周各組大鼠體質(zhì)量變化情況

3.2 各組大鼠門(mén)靜脈壓力結(jié)果的比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠門(mén)靜脈壓力顯著增高（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，普萘洛爾組、鱉甲消癥丸組大鼠門(mén)靜脈壓力顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠門(mén)靜脈壓力結(jié)果的比較（，n =8）

表1 各組大鼠門(mén)靜脈壓力結(jié)果的比較（，n =8）

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜ 0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜ 0.05

3.3 各組大鼠肝組織病理切片結(jié)果的比較 HE 染色結(jié)果：空白對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大小一致、核居中，未見(jiàn)脂肪變性，匯管區(qū)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生。模型對(duì)照組大鼠肝組織可見(jiàn)大量寬厚纖維增生，形成大小不等假小葉，假小葉內(nèi)肝細(xì)胞肝索結(jié)構(gòu)模糊，部分細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性；匯管區(qū)大量纖維組織增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。相比于模型對(duì)照組，普萘洛爾組及鱉甲消癥丸組大鼠肝組織隱約可見(jiàn)纖細(xì)的纖維組織增生及假小葉結(jié)構(gòu)，匯管區(qū)有少量纖維組織增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。Masson染色結(jié)果：空白對(duì)照組大鼠肝組織的纖維組織位于匯管區(qū)周邊，未見(jiàn)分割肝小葉的纖維組織。模型對(duì)照組大鼠肝組織匯管區(qū)周邊可見(jiàn)大量纖維組織增生，寬厚的纖維組織向周邊肝組織延伸，將肝細(xì)胞包繞成大小不等的團(tuán)塊。與模型對(duì)照組比較，普萘洛爾組與鱉甲消癥丸組大鼠肝組織可見(jiàn)染成藍(lán)色的纖維組織增生并形成假小葉，但纖維間隔明顯變窄，匯管區(qū)纖維明顯減少（圖3）。

圖2 各組大鼠肝組織病理切片HE 染色結(jié)果

圖3 各組大鼠肝組織病理切片Masson 染色結(jié)果

3.4 各組大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil 結(jié)果的比較 模型對(duì)照組大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil與空白對(duì)照組比較，有顯著差異（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，普萘洛爾組、鱉甲消癥丸組大鼠血清AST、ALT、TBil 顯著降低（P＜0.01），TP、ALB顯著升高（P＜0.01）。鱉甲消癥丸組大鼠血清AST、TP、ALB 與普萘洛爾組比較，無(wú)顯著差異（P＞0.05），但ALT、TBil 有顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠AST、ALT、TP、ALB、TBil 結(jié)果的比較（，n =8）

表2 各組大鼠AST、ALT、TP、ALB、TBil 結(jié)果的比較（，n =8）

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05；與普萘洛爾組比較，▲P ＜0.05

3.5 各組大鼠血清NO、ET-1、VEGF 結(jié)果的比較 模型對(duì)照組大鼠血清NO、ET-1、VEGF與空白對(duì)照組比較，有顯著差異（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，普萘洛爾組、鱉甲消癥丸組大鼠血清NO、ET-1、VEGF 顯著降低（P＜0.01）。鱉甲消癥丸組大鼠血清NO、ET-1、VEGF 與普萘洛爾組比較，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清NO、ET-1、VEGF 結(jié)果的比較（，n =8）

表3 各組大鼠血清NO、ET-1、VEGF 結(jié)果的比較（，n =8）

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05

3.6 各組大鼠肝組織VEGFR2 表達(dá)量結(jié)果的比較 與空白組比較，模型組VEGFR2 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；普萘洛爾、鱉甲消癥丸均能顯著下調(diào)VEGFR2 的表達(dá)量（P＜0.01），前者作用更加顯著，但都不能使其恢復(fù)到正常水平（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表4、圖4。

圖4 各組大鼠肝組織VEGFR2 表達(dá)量結(jié)果的比較

表4 各組大鼠肝組織VEGFR2 表達(dá)量半定量結(jié)果的比較（，n =8）

表4 各組大鼠肝組織VEGFR2 表達(dá)量半定量結(jié)果的比較（，n =8）

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05；與普萘洛爾組比較，▲P ＜0.05

4 討論

非選擇性β 受體阻滯劑（nonselective beta blocker，NSBB）是肝硬化門(mén)靜脈高壓所致食管胃靜脈曲張的一線(xiàn)藥物、二級(jí)預(yù)防的首選藥物，普萘洛爾屬于傳統(tǒng)的NSBB，是臨床治療肝硬化門(mén)靜脈高壓的常用藥物，通過(guò)同時(shí)阻滯β1、β2 受體，降低心率及心輸出量和使內(nèi)臟血管舒張，從而降低門(mén)靜脈壓力[4]。但NSBB 并非適用于每一例靜脈曲張的患者，約40%的患者服藥后門(mén)脈壓力無(wú)明顯降低[5]，且有多中心隨機(jī)對(duì)照研究顯示，NSBB 不能阻止靜脈曲張的形成[6]。隨著臨床研究的深入，許多學(xué)者認(rèn)為單純西藥治療肝硬化門(mén)靜脈高壓癥存在局限性，而中醫(yī)藥可以發(fā)揮協(xié)同治療作用，同時(shí)有效改善肝纖維化、降低門(mén)靜脈壓力、減少臨床并發(fā)癥等，從而預(yù)防食管胃底靜脈曲張破裂出血[7]。

肝硬化門(mén)靜脈高壓癥根據(jù)臨床表現(xiàn)可歸為中醫(yī)“鼓脹”“脅痛”“積聚”“黃疸”等疾病范疇，中醫(yī)認(rèn)為肝硬化是因肝、脾、腎三臟功能失調(diào)，氣滯、血瘀、水停瘀結(jié)腹中所致，屬于本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證[8-9]。李力強(qiáng)教授根據(jù)本病的病因病機(jī)研制了中藥復(fù)方鱉甲消癥丸，由醋鱉甲、醋三棱、醋莪術(shù)、人工麝香、西洋參、炙黃芪、醋白芍、炒白術(shù)、茯苓、生大黃、生甘草等組成；醋鱉甲入肝消積、軟堅(jiān)散結(jié)，麝香通竅活絡(luò)、活血消癥，為君藥；醋莪術(shù)與醋三棱活血行氣、消癥止痛，為臣藥；西洋參和炙黃芪補(bǔ)益氣血、扶益正氣，醋白芍柔肝止痛，炒白術(shù)和茯苓健脾益氣、利水祛濕，共為佐藥；生大黃活血化瘀、蕩滌濕熱，生甘草緩急止痛、調(diào)和諸藥，共為使藥。諸藥合用，具有益氣活血、化瘀消癥之功效，標(biāo)本同治。二十余年的臨床應(yīng)用表明，鱉甲消癥丸對(duì)預(yù)防肝硬化門(mén)靜脈高壓食管胃靜脈破裂出血、抗肝纖維化等有顯著效果[10-11]，能明顯改善患者肝區(qū)疼痛、黃疸、腹水、蜘珠痣、肝掌、舌邊瘀斑、脾腫大等癥狀；顯著降低門(mén)靜脈壓力和食管靜脈壓力，改善食管靜脈曲張，預(yù)防食管胃靜脈出血；改善肝纖維化，降低肝內(nèi)血管和門(mén)體側(cè)支血管阻力。

本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠肝組織出現(xiàn)大量的纖維增生，小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，形成大小不等的假小葉，部分細(xì)胞脂肪變性，匯管區(qū)可見(jiàn)明顯結(jié)締組織增生。模型組大鼠與空白對(duì)照組比較，門(mén)靜脈壓力顯著增高，血清AST、ALT、TBil、NO、ET-1、VEGF 水平和VEGFR2 表達(dá)顯著升高，TP、ALB 顯著降低，這與既往多項(xiàng)研究結(jié)果一致[12-15]。經(jīng)過(guò)8 周的干預(yù)治療，鱉甲消癥丸組、普萘洛爾組肝組織中的假小葉結(jié)構(gòu)、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞壞死程度都較模型組有顯著改善，表明兩個(gè)藥物均可以有效改善肝硬化大鼠的肝纖維化。鱉甲消癥丸組的AST、TP、ALB 與普萘洛爾組無(wú)明顯差異，但ALT、TBil 顯著高于普萘洛爾組，說(shuō)明普萘洛爾能更有效促進(jìn)肝硬化門(mén)靜脈高壓大鼠肝功能的恢復(fù)。普萘洛爾組、鱉甲消癥丸組大鼠AST、ALT、TBil 均顯著低于模型對(duì)照組，TP、ALB 顯著高于模型對(duì)照組，提示普萘洛爾、鱉甲消癥丸均能有效促進(jìn)肝硬化門(mén)靜脈高壓大鼠肝功能的恢復(fù)。肝硬化門(mén)靜脈高壓癥食管胃底靜脈曲張發(fā)生率與肝功能損害的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，鱉甲消癥丸能逆轉(zhuǎn)肝硬化門(mén)靜脈高壓大鼠的肝功能，進(jìn)一步證實(shí)了鱉甲消癥丸可預(yù)防肝硬化門(mén)靜脈高壓癥食管胃底靜脈曲張破裂出血。普萘洛爾組、鱉甲消癥丸組血清NO、ET-1、VEGF 無(wú)明顯差異，但均顯著低于模型對(duì)照組，表明普萘洛爾、鱉甲消癥丸對(duì)肝硬化門(mén)靜脈高壓大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)有明顯的調(diào)控作用，二者調(diào)控效果相當(dāng)。NO 在肝硬化門(mén)靜脈高壓中形成中具有重要調(diào)控作用，肝硬化時(shí)NO 合成酶的活性降低，導(dǎo)致肝竇內(nèi)皮細(xì)胞NO 產(chǎn)生減少，使星狀細(xì)胞收縮性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致肝內(nèi)血管阻力增加，造成門(mén)靜脈高壓[16]。ET-1 具有強(qiáng)烈持久縮血管和促血管平滑肌細(xì)胞增殖作用，通過(guò)與肝內(nèi)內(nèi)皮素A 受體結(jié)合誘發(fā)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞收縮，導(dǎo)致肝內(nèi)血流阻力增加和肝臟微循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致門(mén)靜脈高壓[17-18]。VEGF 是強(qiáng)效的促血管通透性增強(qiáng)、促血管生成因子，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生，形成新生血管和減少細(xì)胞凋亡，而在促血管再生過(guò)程中可導(dǎo)致血管通透性增高，引起液體滲出增加，加重腹水癥狀[19-20]。鱉甲消癥丸能顯著降低肝硬化門(mén)靜脈高壓大鼠血清NO、ET-1、VEGF 水平，減少肝組織VEGFR2 的表達(dá)量，提示鱉甲消癥丸可能通過(guò)下調(diào)肝硬化門(mén)靜脈高壓大鼠血清NO、ET-1、VEGF/VEGFR2 等血管內(nèi)皮相關(guān)因子釋放及其受體的表達(dá)，達(dá)到減輕肝內(nèi)血管阻力、增強(qiáng)肝臟微循環(huán)、降低肝內(nèi)血管通透性的作用而發(fā)揮綜合療效。

綜上所述，鱉甲消癥丸在受測(cè)劑量下對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝硬化門(mén)靜脈高壓的治療作用與普萘洛爾相當(dāng)，能有效改善肝硬化門(mén)靜脈高壓大鼠肝功能、肝組織纖維化及下調(diào)門(mén)靜脈壓力，其機(jī)制可能與調(diào)控血清NO、ET-1、VEGF/VEGFR2 等血管內(nèi)皮功能相關(guān)因子有關(guān)。