田薊苷對動脈粥樣硬化模型小鼠的改善作用及機(jī)制研究

曹文疆 信盼 趙云麗 袁勇 郭新紅 馬曉莉 黃川生 文志萍 王新春

摘 要 目的 研究田薊苷對動脈粥樣硬化（AS）模型小鼠的改善作用及可能機(jī)制。方法 以8只C57BL/6J小鼠作為正常組;將40只載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠隨機(jī)分為模型組，田薊苷低、中、高劑量組[2.1、3.5、7.0 mg/（kg·d）]和辛伐他汀組[陽性對照藥物，3.5 mg/（kg·d）]，每組8只。正常組小鼠飼以普通飼料，其余各組小鼠飼以高脂飼料建立AS模型。同時，正常組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，每天1次，連續(xù)12周。測定小鼠血漿中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平;觀察小鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)變化;測定小鼠主動脈中細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細(xì)胞間黏附分子1（VCAM-1）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的陽性率;測定小鼠主動脈中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)水平以及TGF-β1、Smad2/3、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠血漿中TC、TG、LDL-C、Ox-LDL、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01），HDL-C水平顯著降低（P<0.01）;主動脈有脂質(zhì)斑塊生成，且斑塊面積較大并致使管腔嚴(yán)重狹窄;主動脈中MMP-2、MMP-9、TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA的表達(dá)水平，ICAM-1、VCAM-1、PCNA蛋白表達(dá)陽性率以及TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組上述指標(biāo)水平大部分均顯著回調(diào)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 田薊苷可能是通過抑制TGF-β1/Smads信號通路的激活，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來抑制AS的形成。

關(guān)鍵詞 田薊苷;動脈粥樣硬化;轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smads信號通路;炎癥反應(yīng);脂質(zhì)代謝

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）01-0019-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.01.04

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the improvement effects of tilianin on the atherosclerosis （AS） model mice and its potential mechanism. METHODS Eight C57BL/6J mice were taken as the normal group. Forty ApoE-/- mice were randomly divided into model group， tilianin low-dose， medium-dose and high-dose groups [2.1， 3.5， 7.0 mg/（kg·d）] and simvastatin group [positive control drug， 3.5 mg/（kg·d）]， with 8 mice in each group. Normal group was given normal diet， and other groups were given high-lipid diet to induce AS model. At the same time， normal group and model group were given normal saline intragastrically， administration groups were given relevant drug intragastrically， once a day， for 12 consecutive weeks. The levels of TC， TG， LDL-C， HDL-C， Ox-LDL， IL-1β， IL-6， MCP-1 and TNF-α in plasma were determined. The pathomorphological changes of the aorta in mice were observed. The positive rate of ICAM-1， VCAM-1 and PCNA in the aorta were determined. mRNA expressions of MMP-2， MMP-9， TGF-β1， Smad2 and Smad3 as well as protein expressions of TGF-β1， Smad2/3 and p-Smad2/3 were also determined in aorta of mice. RESULTS Compared with normal group， the plasma levels of TC，TG， LDL-C， Ox-LDL， IL-1β， IL-6， MCP-1 and TNF-α in model group were increased significantly （P<0.01）， while HDL-C level was significantly reduced （P<0.01）. Lipid plaques were formed in the aorta， and the plaque area was large and caused severe stenosis of the lumen. mRNA expressions of MMP-2， MMP-9， TGF-β1， Smad2 and Smad3 as well as positive rate of? ICAM-1， VCAM-1， PCNA and protein expression TGF-β1， Smad2/3， and p-Smad2/3 in the aorta were significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， most of above indexes of medication groups were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS Tilianin can inhibit the activation of TGF-β1/Smads signaling pathway and then inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells， reduce inflammation and regulate lipid metabolism to inhibit the formation of AS.

KEYWORDS? ?tilianin; atherosclerosis; TGF-β1/Smads signaling pathway; inflammation; lipid metabolism

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種動脈血管壁的慢性進(jìn)行性疾病，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖、遷移與AS斑塊纖維帽及新生血管的生成具有重要聯(lián)系[1]。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一類具有多種生物學(xué)功能的生長因子，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化和遷移等過程;其不僅可刺激多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的合成與分泌，還可參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解[2]。而在TGF-β家族中，又以TGF-β1的功能最多、活性最強(qiáng)、分布最廣。Smads蛋白家族是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要分子，介導(dǎo)信號從細(xì)胞膜向細(xì)胞核的傳遞[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smads信號通路可刺激炎癥介質(zhì)生成、參與血管新生、調(diào)控VSMC的增殖與遷移，而這些過程在AS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[4-6]。

香青蘭Dracocephalum moldavica L.為唇形科青蘭屬一年生草本植物，以地上全草入藥，具有清熱燥濕、涼肝止血的功效[7]。香青蘭中主要含黃酮類、多糖、萜類等成分，其中黃酮類成分具有抗炎、抗氧化、保護(hù)心肌及抗AS等作用[8-9]。田薊苷是香青蘭總黃酮中的主要活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用，對AS具有一定的防治作用[10-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，田薊苷可以抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠VSMC過度增殖和遷移，并且此過程涉及TGF-β1/Smads信號通路的激活和調(diào)控[14]。因此，本研究以載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠為動物模型，研究田薊苷是否能通過調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路來抑制ApoE-/-小鼠AS的形成，為進(jìn)一步闡明田薊苷抑制AS的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有5430R小型臺式高速低溫冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），XL-200型低速離心儀器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），EM-UC6型超薄型切片儀、RM2245型半自動石蠟切片機(jī)（美國Leica公司），VE-180型垂直電泳及電轉(zhuǎn)儀（上海天能科技有限公司），EC3600型凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司），Rotor-Gene Q型實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（德國Qiangen公司），Modular DPP-H7600型全自動生化分析儀（德國羅氏診斷有限公司），TES99型石蠟包埋機(jī)（湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司），CKX53型常規(guī)倒置顯微鏡（日本Olympus公司），M200 Pro型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tacan公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑包括：田薊苷（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，批號20100626，純度≥98%），辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司，批號M042689，規(guī)格為20 mg/片），4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司，批號11K17B68），蘇木精（美國Sigma公司，批號SLBP6815V），伊紅（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號100715），二甲苯（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號20150519），二氨基聯(lián)苯胺（DAB，丹麥丹科股份有限公司，批號20039541），兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號10494-1-AP），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號分別為131879、131224），小鼠氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1beta，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為AK0017OCT19007、AK0017OCT19004、AK0017OCT19006、AK0017OCT19003、AK0017OCT- 19005），動物組織總RNA提取試劑盒、QuantiNovaTM SYBR? Green PCR Kit（北京天根生化科技有限公司，批號分別為Q5920、154045739），cDNA合成試劑盒、ECL超敏發(fā)光試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號分別為00422714、RJ238588），RIPA 組織細(xì)胞裂解液、磷酸酶抑制劑混合物（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20150319、P1260），小鼠源TGF-β1單克隆抗體、兔源Smad2/3單克隆抗體、兔源磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）多克隆抗體、小鼠源細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）單克隆抗體、兔源血管細(xì)胞間黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）單克隆抗體、兔源增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（英國Abcam Cambridge公司，批號分別為ab64715、ab202445、ab272332、ab171123、ab134047、ab92552）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。PCR實(shí)驗(yàn)中的引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成。

1.3 動物

本研究所用動物為健康雄性SPF級ApoE-/-小鼠（40只）和健康雄性SPF級C57BL/6J小鼠（8只）。兩種小鼠均為8周齡，體質(zhì)量20～24 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)合格證號均為SCXK（京）2016-0011。所有小鼠均單籠單只飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食和飲水。動物房環(huán)境溫度為22～25 ℃、相對濕度為50%～60%、每天的光照時間為12 h。本實(shí)驗(yàn)過程滿足動物實(shí)驗(yàn)“3R”原則。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

小鼠經(jīng)過2周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。以8只C57BL/6J小鼠作為正常組;將40只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組，田薊苷低、中、高劑量組[2.1、3.5、7.0 mg/（kg·d）][11]和辛伐他汀組[陽性對照藥物，3.5 mg/（kg·d）][15]，每組8只。正常組小鼠飼以普通飼料，其余各組小鼠均通過飼以高脂飼料（0.75%膽固醇、15%豬油和84.25%基礎(chǔ)飼料）的方式建立AS模型，連續(xù)飼養(yǎng)12周[13]。同時，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物（均以生理鹽水為溶劑溶解），正常組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)12周。

2.2 樣本取材及處理

末次灌胃24 h后，小鼠先禁食不禁水12 h，然后摘眼球取血。將血樣置于含肝素鈉的抗凝管中，以3 000? r/min離心10 min，分離血漿并分裝。將部分血漿用于血脂指標(biāo)檢測;部分血漿于-80 ℃保存，備用。取血后將小鼠處死，開胸剪取主動脈，剝離外膜脂肪組織，然后用預(yù)冷的滅菌生理鹽水沖洗主動脈。取洗凈后的主動脈根部（長約1.0 cm），置于4%多聚甲醛溶液中固定;其余的主動脈用錫箔紙包裹并標(biāo)記好后迅速置于液氮中冷凍，再于-80 ℃保存，備用。

2.3 血漿中血脂指標(biāo)水平檢測

取“2.2”項下血漿，采用全自動生化分析儀檢測血漿中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyce- ride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。

2.4 血漿中Ox-LDL、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平檢測

采用ELISA法進(jìn)行檢測。取“2.2”項下血漿，按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定血漿中Ox-LDL、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α的水平。

2.5 主動脈病理形態(tài)學(xué)變化觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進(jìn)行觀察。取4%多聚甲醛溶液固定的主動脈，常規(guī)制備石蠟切片（厚度約5 μm），行常規(guī)HE染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.6 主動脈中ICAM-1、VCAM-1、PCNA蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組化法進(jìn)行測定。取4%多聚甲醛溶液固定的主動脈，常規(guī)制備石蠟切片（厚度約5 μm），60 ℃脫蠟后，在100 ℃下用pH 6.0的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液修復(fù)5 min，然后在25 ℃下用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性10 min;加入ICAM-1一抗（稀釋比例1 ∶ 100）、VCAM-1一抗（稀釋比例1 ∶ 125）、PCNA一抗（稀釋比例1 ∶ 200），4 ℃孵育過夜;加入相應(yīng)二抗（稀釋比例1 ∶ 500），37 ℃孵育30 min;進(jìn)行磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌、DAB顯色、蘇木精染色、封片后，在光學(xué)顯微鏡下檢測。ICAM-1和VCAM-1主要在胞漿中表達(dá)，胞漿陽性染色呈棕黃色。通過Image-Pro Plus 6.0軟件計算棕黃色部位的平均光密度（IOD）值和陽性表達(dá)蛋白的分布面積，計算2種蛋白的陽性率[陽性率（%）=IOD值/陽性表達(dá)蛋白的分布面積×100%]。PCNA主要在細(xì)胞核中表達(dá)，細(xì)胞核陽性染色呈棕色，陰性染色呈藍(lán)色。通過Image-Pro Plus 6.0軟件計數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)和視野中所有細(xì)胞個數(shù)，并計算PCNA陽性率[陽性率（%）=（陽性細(xì)胞個數(shù)/視野中所有細(xì)胞個數(shù)）×100%]。

2.7 主動脈中MMP-2、MMP-9、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)的檢測

采用qRT-PCR法進(jìn)行檢測。取“2.2”項下凍存的主動脈，常規(guī)解凍后，按動物組織總RNA抽提試劑盒方法提取組織中的總RNA;驗(yàn)證其純度后，按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法合成cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共20 μL）：2×QuantiNova SYBR Green PCR Master mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸15 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的mRNA表達(dá)水平。引物序列及產(chǎn)物擴(kuò)增長度見表1。

2.8 主動脈中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)的檢測

采用Western blot法進(jìn)行測定。取“2.2”項下凍存的主動脈，常規(guī)解凍后，采用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取組織中的總蛋白;測定蛋白的濃度和純度后，將蛋白進(jìn)行高溫變性。取變性后蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠電壓100 V、濃縮膠電壓80 V，電泳時間2 h），濕法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上（電流200 mA，轉(zhuǎn)膜時間2 h），用5%脫脂奶粉或5%牛血清白蛋白封閉1 h;加入TGF-β1一抗（稀釋比例1 ∶ 1 000）、Smad2/3一抗（稀釋比例1 ∶ 1 000），p-Smad2/3一抗 （稀釋比例1 ∶ 1 000）、GAPDH一抗（稀釋比例1 ∶ 5 000），4 ℃孵育過夜;TBST洗膜10 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例1 ∶ 20 000），室溫孵育1 h;加入ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像、顯影。用Image J 1.8.0軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參（GAPDH）蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 田薊苷對AS模型小鼠血漿中血脂水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血漿中TG、TC、LDL-C水平均顯著升高（P<0.01），HDL-C水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠血漿中TG水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;田薊苷高劑量組和辛伐他汀組小鼠血漿中TC水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;田薊苷中、高劑量組和辛伐他汀組小鼠血漿中LDL-C水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠血漿中血脂指標(biāo)水平測定結(jié)果見表2。

3.2 田薊苷對AS模型小鼠血漿中Ox-LDL水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血漿中Ox-LDL水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠血漿中Ox-LDL水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠血漿中Ox-LDL水平測定結(jié)果見表3。

3.3 田薊苷對AS模型小鼠血漿中IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血漿中IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，除田薊苷低劑量組小鼠血漿中TNF-α水平降低不顯著外（P>0.05），其余各組小鼠血漿中上述指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠血漿中IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平測定結(jié)果見表4。

3.4 田薊苷對AS模型小鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)的影響

正常組小鼠主動脈層次清晰，內(nèi)膜完整，無泡沫細(xì)胞與膽固醇結(jié)晶形成;管腔未發(fā)生明顯狹窄，且無脂質(zhì)斑塊生成。模型組小鼠主動脈層次紊亂，有脂質(zhì)斑塊生成，且斑塊面積較大并呈現(xiàn)向管腔發(fā)展的占位性病變;管腔嚴(yán)重狹窄，斑塊脂質(zhì)核心大，存在大量泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶。田薊苷各劑量組和辛伐他汀組小鼠主動脈層次有所改善，斑塊面積減小;管腔狹窄程度明顯減輕，斑塊脂質(zhì)核心小，斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶減少。各組小鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖1。

3.5 田薊苷對AS模型小鼠主動脈中ICAM-1、VCAM-1和 PCNA蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠主動脈中ICAM-1、VCAM-1和PCNA蛋白表達(dá)的陽性率均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠主動脈中上述蛋白表達(dá)的陽性率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠主動脈中ICAM-1、VCAM-1和 PCNA蛋白表達(dá)的免疫組化圖見圖2，蛋白表達(dá)的陽性率測定結(jié)果見表5。

3.6 田薊苷對AS模型小鼠主動脈中MMP-2、MMP-9、TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠主動脈中MMP-2、MMP-9、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠主動脈中上述因子 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠主動脈中MMP-2、MMP-9、TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA的表達(dá)水平測定結(jié)果見表6。

3.7 田薊苷對AS模型小鼠主動脈中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠主動脈中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠主動脈中上述蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。各組小鼠主動脈中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)的電泳圖見圖3，蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果見表7。

4 討論

載脂蛋白E可特定地與外周細(xì)胞受體結(jié)合，對脂蛋白成分的正常分解、代謝至關(guān)重要;敲除ApoE基因后，會影響膽固醇與細(xì)胞表面的脂蛋白結(jié)合，造成膽固醇無法降解，膽固醇蓄積會導(dǎo)致AS的發(fā)生[16]。本研究選用ApoE-/-小鼠為動物模型進(jìn)行研究。以高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠后，容易形成AS，而AS的主要臨床表現(xiàn)為血脂水平升高和斑塊形成[17]，因此，控制血脂水平、抑制斑塊形成對防治AS具有重要意義。臨床上常用辛伐他汀治療高脂血癥，其可降低血脂水平（如TC、TC、LDL-C等），因此本研究選擇辛伐他汀作為陽性對照藥物。結(jié)果顯示，模型組小鼠血漿中TG、TC、LDL-C水平均顯著升高，主動脈內(nèi)可見明顯的AS斑塊，說明以高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠可成功建立AS模型;而給予不同劑量田薊苷后，AS模型小鼠血漿中TG、TC、LDL-C水平均不同程度地降低，AS斑塊均不同程度地減小，說明田薊苷具有降低血脂水平和抑制斑塊形成的作用。

AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥被認(rèn)為是AS發(fā)病的主要危險因素[18-19]。Ox-LDL可以促進(jìn)脂質(zhì)堆積，導(dǎo)致AS斑塊形成[20]。本研究通過檢測小鼠血漿中脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)Ox-LDL水平和炎癥標(biāo)志物IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1的水平發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血漿中Ox-LDL、IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1水平均顯著升高，而不同劑量田薊苷均可不同程度地降低AS模型小鼠血漿中上述指標(biāo)的水平，說明田薊苷可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抑制炎癥反應(yīng)。

ICAM-1和VCAM-1均屬于黏附分子免疫球蛋白家族，主要參與細(xì)胞的識別和黏附，兩者均可介導(dǎo)細(xì)胞的黏附、遷移和分化，使單核細(xì)胞、白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等在血管內(nèi)壁大量堆積，致使血管發(fā)生炎癥和形成斑塊[21]。PCNA表達(dá)水平的高低可反映VSMC增殖能力的大小，其表達(dá)水平越高表示VSMC的增殖能力越強(qiáng)[22]，而VSMC大量增殖會促進(jìn)斑塊壞死核心的形成[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠主動脈中ICAM-1、VCAM-1和PCNA蛋白表達(dá)的陽性率均明顯升高，而不同劑量田薊苷均可降低AS模型小鼠主動脈中上述蛋白表達(dá)的陽性率，說明田薊苷可通過抑制細(xì)胞的黏附和VSMC的增殖、遷移來抑制AS斑塊的形成。

在AS的發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和泡沫細(xì)胞均可以合成和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs），其中MMP-2與MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定和破裂[24]，而不穩(wěn)定斑塊是血栓形成的主要原因[25]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠主動脈中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，而不同劑量田薊苷均可降低AS模型小鼠主動脈中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)水平，說明田薊苷可起到穩(wěn)定斑塊的作用。

TGF-β1/Smads信號通路的激活是許多血管疾病的標(biāo)志[1]。TGF-β1具有促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤、VSMC增殖和遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積等作用[2]，Smad2和Smad3是TGF-β1/Smads信號通路的重要下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和靶點(diǎn)[3]，激活TGF-β1/Smads信號通路會促進(jìn)VSMCs增殖和基質(zhì)合成[26-27]，從而導(dǎo)致AS斑塊形成。因此，抑制TGF-β1/Smads通路的激活可減少炎癥介質(zhì)生成、抑制VSMC增殖和AS斑塊形成。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠主動脈中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)和TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，而不同劑量田薊苷均可下調(diào)AS模型小鼠主動脈中上述因子mRNA和蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果說明，田薊苷可通過抑制TGF-β1及其下游信號分子Smad2/3、p-Smad2/3的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制VSMC增殖和遷移的作用。

綜上所述，田薊苷可能是通過抑制TGF-β1/Smads信號通路的信號傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制VSMC增殖、減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來抑制AS的形成，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步確定。

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（收稿日期：2021-07-25 修回日期：2021-11-22）

（編輯：林 靜）