高表達(dá)miR-3682-3p是肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后因素

劉紹華，溫瑩浩，全 兵，藺 軍，朱澤文，湯江林，韓思源

萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院1普外科，2腫瘤科，5重癥監(jiān)護(hù)室，江西 萍鄉(xiāng) 337000；3南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州 510220；4東莞市松山湖中心醫(yī)院腫瘤科，廣東 東莞523000

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種異質(zhì)性癌癥，已有多種已 知病因，如乙型肝炎病毒（HBⅤ）或丙型肝炎病毒感染或黃曲霉毒素暴露，這些因素單獨(dú)或聯(lián)合長(zhǎng)期作用于肝臟，可導(dǎo)致基因表達(dá)的慢性失衡［1-3］，并最終促進(jìn)了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。MicroRNA（miRNA）參與包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制［4-13］。MiR-3682-3p是一個(gè)與腫瘤發(fā)病相關(guān)的miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-3682-3p在食管癌中高表達(dá)［14］。在HCC中，外泌體中miR-3682-3p通過(guò)改變Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑靶向血管生成素1（Ang-1），從而抑制血管生成，外泌體中miR-3682-3p在HCC發(fā)病中可能發(fā)揮了候選腫瘤抑制因子［15］作用。然而，在另一項(xiàng)肝癌研究中，實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)結(jié)果卻顯示，miR-3682-3p在HCC中高表達(dá)，其表達(dá)增加促進(jìn)了HCC發(fā)病和不良預(yù)后［16］，提示其在HCC中發(fā)揮了腫瘤促進(jìn)作用。這兩項(xiàng)研究結(jié)果相互矛盾，且相對(duì)較短的隨訪(fǎng)時(shí)間可能導(dǎo)致結(jié)論存在偏差［16］。因此需要對(duì)miR-3682-3p在HCC中的作用進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究對(duì)miR-3286-3p在HCC中的表達(dá)及其與臨床參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了檢測(cè)和分析，以明確miR-3286-3p在HCC發(fā)病過(guò)程中的作用。

1 資料和方法

1.1 生物信息學(xué)分析

使用UALCAN（TCGA 數(shù)據(jù)）網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/)確定miR-3682（miR-3682-3p）的表達(dá)及其與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.2 臨床樣本

18配對(duì)肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織來(lái)自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（液氮新鮮保存），其中男性12例，女性6例，發(fā)病年齡27～82歲，中位年齡53.5歲。90對(duì)石蠟包埋的HCC標(biāo)本和其癌旁組織芯片［上海芯超生物技術(shù)有限公司（中國(guó)上海）］HLivH180Su15，病理類(lèi)型均為肝細(xì)胞癌（http://www.superchip.com.cn/biology/tissue.html），樣本收集于2007～2008年，隨訪(fǎng)至2016年。所有病例均為手術(shù)切除，術(shù)前未經(jīng)任何放化療和其他治療，并分別獲得貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和上海芯超生物技術(shù)有限公司倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（2 020025;SHY-JS-1901001）。

1.3 原位雜交（ISH）

應(yīng)用ISH對(duì)石蠟包埋的90對(duì)肝癌和癌旁組織芯片標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)［17］。切片在二甲苯中脫蠟，并在不同乙醇濃度下進(jìn)行梯度脫水處理。用蛋白酶K處理37 ℃、30 min，沖洗、固定切片，然后預(yù)混合2 h。將樣品與BersinBio（中國(guó)廣州）設(shè)計(jì)和合成的miRCURY miR-3682-3p地高辛標(biāo)記探針雜交。沖洗載玻片，在室溫下與與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗地高辛抗體的Fab片段孵育1 h。添加3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（中國(guó)福州美新生物科技有限公司）觀察信號(hào)，并按照文獻(xiàn)［4］方法由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，分別對(duì)染色強(qiáng)度和染色面積進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性著色面積＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，75%～100%為4分；染色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者計(jì)分的乘積為陽(yáng)性等級(jí)：6分以下為低表達(dá)，6分及6分以上為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0進(jìn)行分析。使用配對(duì)t檢驗(yàn)分析基因差異表達(dá)；通過(guò)卡方檢驗(yàn)評(píng)估基因表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)用于分析基因表達(dá)與患者總生存率之間的關(guān)系。使用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單變量和多變量生存分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析miR-3682（miR-3682-3p）的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性

基于TCGA數(shù)據(jù)，使用UALCAN網(wǎng)站上的算法進(jìn)行的分析顯示，與鄰近組織相比，miR-3682在HCC中明顯高表達(dá)（t=4.149，P＜0.001，圖1A）。生存分析顯示，miR-3682 表達(dá)越高，患者的綜合生存時(shí)間越短（χ2=8.793，P＜0.001，圖1B）。

圖1 生物信息學(xué)分析miR-3682-3p表達(dá)水平與患者的預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Bioinformatics analysis of miR-3682-3p expression levels in relation to the patients' prognosis.A:MiR-3682 expression in HCC tissues and adjacent tissues based on data from TCGA database (P＜0.001).B:Relationship between miR-3682 expression and the patients'prognosis based on data from TCGA database.

2.2 RT-PCR檢測(cè)miR-3682-3p在肝癌中的表達(dá)

為驗(yàn)證生物信息學(xué)結(jié)果，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)18對(duì)癌組織與它們匹配的癌旁組織中miR-3682-3p的表達(dá)。配對(duì)t檢驗(yàn)顯示，與18個(gè)非癌對(duì)照組織相比，miR-3682-3p在18個(gè)肝癌組織中總體表達(dá)水平升高（t=3.073，P=0.007，圖2）。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-3682-3p在18對(duì)配對(duì)新鮮肝癌組織和它們鄰近癌旁組織中的表達(dá)水平（藍(lán)點(diǎn)和紅點(diǎn)分別代表癌旁組織和癌組織）Fig.2 MiR-3682-3p mRNA expression level in 18 pairs of fresh HCC tissues (red dots) and adjacent tissues (blue dots) detected by real-time fluorescence quantitative PCR(**P＜0.01).

2.3 miR-3682-3p的原位雜交及亞細(xì)胞定位

原位雜交技術(shù)檢測(cè)組織芯片中90例HCC和癌旁組織中miR-3682-3p的表達(dá)，并分析其亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，miR-3682-3p定位于HCC和癌旁組織的細(xì)胞漿中（圖3A）。與癌旁組織相比，miR-3682-3p在HCC中上調(diào)（t=2.659，P=0.009，圖3B）。

圖3 原位雜交法檢測(cè)肝癌和癌旁組織中miR-3682-3p的表達(dá)Fig.3 Expression of miR-3682-3p detected by in situ hybridization in HCC and adjacent tissues.A: In situ hybridization of miR-3682-3p in HCC tissues and adjacent tissues (Scale bar:50 μm).B:MiR-3682-3p is upregulated in HCC tissues compared with the adjacent tissues based on tissue microarrays (TMA) cell staining score (**P＜0.01).

2.4 miR-3682-3p的表達(dá)與肝癌臨床進(jìn)展的相關(guān)性

miR-3682-3p表達(dá)的高低在美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第八版分期（χ2=4.272，P=0.039）、HBⅤ表面抗原狀態(tài)（χ2=5.143，P=0.023）、復(fù)發(fā)（χ2=4.593，P=0.032）、腫瘤大?。é?=4.580，P=0.032）和Edmondson-Steiner分級(jí)（χ2=4.068，P=0.044）方面差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在年齡、性別、腫瘤數(shù)量、甲胎蛋白、總膽紅素、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 MiR-3682-3p表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系Tab.1 Correlations between miR-3682-3p expression and clinicopathological features of HCC patients

2.5 miR-3682-3p表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后的關(guān)系

在90例有預(yù)后信息的肝癌患者中，miR-3682-3p表達(dá)越高，患者總生存時(shí)間越短（χ2=4.169，P=0.041，圖4A），無(wú)病生存時(shí)間越短（χ2=4.078，P=0.043，圖4B）。單變量分析顯示，患者生存率也與miR-3682-3p 表達(dá)（HR=0.242［95%CI0.111-0.525］，P＜0.001）、Edmondson-Steiner分級(jí)（HR=7.860［95%CI3.479-3.497］，P＜0.001）、GGT水平（HR=0.386［95%CI0.159-0.937］，P=0.035）、腫瘤大?。℉R=0.169［95%CI0.084-0.342］，P＜0.001）和AJCC分期（HR=3.088［95%CI1.535-6.212］，P=0.002）有關(guān)。為了確定miR-3682-3p是否是HCC的獨(dú)立預(yù)后因素，對(duì)HCC患者中miR-3682-3p的表達(dá)進(jìn)行了多變量分析，并根據(jù)Edmondson-Steiner 分級(jí)、腫瘤大小、GTT水平和AJCC分期進(jìn)行調(diào)整。結(jié)果顯示，miR-3682-3p表達(dá)水平是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素［HR=0.368（95%CI0.161-0.842），P=0.018，表2］。

圖4 Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析miR-3682-3p表達(dá)與肝癌患者總生存率和無(wú)病生存率的關(guān)系Fig.4 Kaplan-Meier survival analysis of the correlation of miR-3682-3p expression with the overall survival and disease-free survival of HCC patients.A:Overall survival rate was markedly lower in patients with high miR-3682-3p expression level than in those with low miR-3682-3p expression (P=0.041,log-rank test).B:Disease-free survival rate was markedly lower in patients with high miR-3682-3p expression level than in those with low miR-3682-3p expression level(P=0.043,log-rank test).

表2 肝癌患者臨床病理變量的單因素和多因素生存分析Tab.2 Univariate and multivariate survival analysis of clinicopathological variables of HCC patients

3 討論

許多miRNAs參與了HCC的發(fā)病機(jī)制［4-10］，包括最近發(fā)現(xiàn)的miR-3682-3p。目前，關(guān)于miR-3682-3p在腫瘤中作用的研究?jī)H限于食管癌和HCC，研究結(jié)論也存在矛盾［14-16］，提示miR-3682-3p在腫瘤中可能發(fā)揮了相當(dāng)復(fù)雜的作用。有研究對(duì)OncoMir數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-3682-3p 在HCC 中表達(dá)顯著增加，qPCR檢測(cè)也獲得了一致的結(jié)果［16］，并且miR-3682-3p高表達(dá)與臨床進(jìn)展呈明顯正相關(guān)，而與不良預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)，表明miR-3682-3p作為候選癌基因促進(jìn)HCC的發(fā)病過(guò)程［16］。而有研究顯示，HCC外泌體中的miR-3682-3p能抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)，降低Ang-1的生成，從而抑制血管生成，提示外泌體中miR-3682-3p在HCC發(fā)病發(fā)揮了候選抑癌基因作用［15］，該結(jié)論與Yao等［16］結(jié)果存在明顯不同，提示miR-3682-3p在HCC發(fā)病中的復(fù)雜性，有必要進(jìn)一步明確miR-3682-3p在HCC中作用。因此，本研究應(yīng)用多種方法檢測(cè)了miR-3682-3p在HCC和肝組織樣本中miR-3682-3p的表達(dá)，并重新分析了miR-3682-3p在HCC表達(dá)與臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

本研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，miR-3682-3p在肝癌組織中的表達(dá)明顯升高，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)也顯示了同樣的結(jié)果，這與部分報(bào)道相一致［16］，支持了miR-3682-3p 在OncoMir 數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)果的可靠性。因既往研究的方法僅限于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，本研究進(jìn)一步應(yīng)用原位雜交方法對(duì)miR-3682-3p的表達(dá)情況進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果同樣顯示為miR-3682-3p在HCC中的表達(dá)明顯升高。本研究明確回答了既往存在爭(zhēng)議的問(wèn)題，支持miR-3682-3p在HCC中呈高表達(dá)，為進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-3682-3p表達(dá)在HCC中的意義提供了前提和依據(jù)。

HBⅤ感染是HCC發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素［18-20］，本研究發(fā)現(xiàn)miR-3682-3p高表達(dá)與HBⅤ感染有關(guān)，HBⅤ感染可能參與了對(duì)miR-3682-3p的誘導(dǎo)表達(dá)。此外，miR-3682-3p的表達(dá)與AJCC分期、腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤大小以及Edmondson-Steiner分級(jí)等多個(gè)因素存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，而腫瘤復(fù)發(fā)和生長(zhǎng)等被認(rèn)為與腫瘤干性增加有關(guān)［21-23］，提示miR-3682-3p的表達(dá)可能促進(jìn)對(duì)HCC腫瘤干性信號(hào)的調(diào)節(jié)，從而誘導(dǎo)HCC復(fù)發(fā)、細(xì)胞增殖和惡性進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持miR-3682-3p作為刺激HCC發(fā)病的潛在癌基因的結(jié)論。

前期有研究報(bào)告了miR-3682-3p表達(dá)與肝癌患者3年生存時(shí)間的相關(guān)性［16］。本研究進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，miR-3682-3p表達(dá)越高，肝癌患者總生存時(shí)間越短。并且，高表達(dá)miR-3682-3p的HCC患者的無(wú)病生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者，表明miR-3682-3p高表達(dá)是促進(jìn)HCC患者預(yù)后不良因素。本研究多變量分析顯示，經(jīng)調(diào)整了AJCC分期、腫瘤大小、Edmondson-Steiner分級(jí)和GGT水平，miR-3682-3p表達(dá)增加是肝癌患者預(yù)后不良的重要獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

綜上所述，本研究通過(guò)多種檢測(cè)方法，證明了miR-3682-3p在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，是促進(jìn)HCC發(fā)病和預(yù)后不良的重要因子，明確回答了這個(gè)既往存在爭(zhēng)議的問(wèn)題，為研究miR-3682-3p在腫瘤中的作用提供了新的證據(jù)。然而，關(guān)于miR-3682-3p在HCC中的作用機(jī)制仍未闡明，今后需要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)機(jī)制方面的研究，為miR-3682-3p真正應(yīng)用于腫瘤的臨床治療提供依據(jù)和方向。