CDAN1基因突變導致的胎兒期非免疫性水腫的家系遺傳學分析

王燕超，黎 青，孫筱放，李少英，何健淳，張敏聰，黃玲玲，何文智

1廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所實驗部，廣東 廣州 510150；2廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室，廣東 廣州 510150；3廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室，廣東 廣州510150

非免疫性水腫（NIHF）是目前引起胎兒水腫的最常見原因，研究表明遺傳因素（如單基因遺傳病、染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常）、血液病、感染和心血管疾病均可導致非免疫性胎兒水腫［1-3］。先天性紅細胞生成障礙性貧血（CDA）是一種罕見的孟德爾遺傳病，該病以大紅細胞貧血、無效紅細胞生成和發(fā)育不良為主要特征［4］。OMIM數(shù)據(jù)庫根據(jù)臨床癥狀和突變基因的不同，可將CDA分為5種類型［5］：即CDA I型（CDAN1基因和C15ORF41基因）、CDA Ⅱ型（SEC23B基因）、CDA Ⅲ型（KIF23基因）、CDA Ⅳ型（KLF1基因）和XLTDA（GATA1基因）。約75%CDA I 型是由于15號常染色體上CDAN1基因復合雜合突變所致［6］，其特點是在兒童、青少年或以后的生活中出現(xiàn)中度至重度的大細胞性貧血［7］。目前，國內(nèi)暫無CDA I型基因檢測相關中文研究報道，國際上有關該疾病的研究對象大多為青少年和兒童，且主要側(cè)重研究患者血液學參數(shù)與紅細胞形態(tài)變化以及分析該病的臨床癥狀和治療方案。有關該疾病在胎兒期的報道非常少，研究者發(fā)現(xiàn)該基因變異可導致胎兒溶血性貧血、水腫、肝脾腫大和嚴重肺動脈高壓［6,8］?？偠灾?，該基因不同位點的變異可表現(xiàn)在不同時期（胎兒期、兒童期、青少年期和成人期）和不同嚴重程度（從中度至重度貧血）。分析該疾病在各個不同時期的臨床表現(xiàn)，有助于擴展臨床醫(yī)生對該病的病程認識，加深對基因型-表現(xiàn)型關聯(lián)的理解，也有助于臨床對胎兒水腫的病因?qū)W認識。

本研究采用全外顯子組測序技術（WES）分析了1例先天性紅細胞生成障礙性貧血1型家系，檢測到引產(chǎn)胎兒的CDAN1基因存在復合雜合突變，找到了該家系孕期胎兒非免疫性水腫的遺傳學病因，為該家系后續(xù)生育指導和出生缺陷防控提供了科學解釋和理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對象

孕婦22周歲，G1P1，于我院產(chǎn)前診斷科就診，孕17周超聲提示胎兒水腫綜合征，肝脾增大，心包缺損，孕婦本人要求終止妊娠，并行羊膜腔引產(chǎn)術查因。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（醫(yī)倫會審［2021］第115號），所有基因診斷均取得患者家屬的同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA提取 采集胎兒引產(chǎn)組織和羊水細胞及其父母外周靜脈血各5 mL，EDTA-K2 抗凝。采用Qiagen 微量DNA 提取試劑盒（Qiagen），按照說明書提取基因組DNA，并放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 羊水細胞培養(yǎng)和G顯帶核型分析 取20 mL羊水分2 管，轉(zhuǎn)速1800 r/min 離心10 min，棄上清，留取約0.5 mL細胞懸液，加入1 mL新鮮羊水培養(yǎng)基，混勻，37 ℃，5%CO2進行原代培養(yǎng)，收獲細胞后按照標準流程進行G顯帶染色，按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準（WS322.2-2010）分析羊水細胞染色體，常規(guī)計數(shù)20個細胞，分析3～5個核型。

1.2.3 全基因組拷貝數(shù)變異測序 采用基因組拷貝數(shù)異常檢測試劑盒（貝康醫(yī)療）進行文庫構(gòu)建和后續(xù)實驗，測序采用DA8600（達安基因）高通量測序儀對引產(chǎn)組織樣本100 kb以上已知明確致病的CNⅤs，以及1 Mb以上的片段缺失/重復進行檢測。

1.2.4 全外顯子組測序 使用Agilent's SureSelectXT Human All Exon Ⅴ6（Agilent）進行外顯子捕獲測序,使用Illumina NovaSeq 6000測序系統(tǒng)進行人類全基因外顯子組高通量測序。

1.2.5 測序結(jié)果分析 采用BWA軟件對所獲得的序列進行比對，使用GATK 對序列進行重排，并對變異（SNPs、indels）進行識別、注釋和統(tǒng)計分析。

1.2.6 變異位點檢測 用Sanger測序?qū)ο茸C者及家系成員進行突變檢測和驗證。采用Primer Primer5.0軟件設計CDAN1基因：c.1264和c.2140位點上下游序列擴增引物，由上海生工科技有限公司合成，引物序列為：CDAN1-F1：GGCTGCTGTGCTTCTCACC，CDAN1-R1：GTCATCTCATTCCCTCCCCA。CDAN1-F2：CT GGATGTGCGGACTCTGC，CDAN1-R2：TGGGGAC TGTCTCTCAGCG PCR擴增產(chǎn)物用ABI3500XL測序儀（美國Applied Biosystems公司）進行一代測序。使用DNASTAR軟件查看Sanger測序結(jié)果并與人類基因組序列進行比較。

1.2.7 變異位點的致病性分析CNⅤ-Seq 將測序得到的reads與已知人類參考基因組（hg19）進行比對。CNⅤ片段結(jié)果與DECIPHER、OMIM、DGⅤ、C1inⅤar 等數(shù)據(jù)庫進行比對和關聯(lián)表型的注釋。WES-Trios:查詢HGMD（Human Gene Mutation Database）、SNP/Ex AC、gnomAD和1000 Genomes Project數(shù)據(jù)庫，對新發(fā)現(xiàn)的變異位點采用SIFT、I-mutant2、PolyPhen-2 及PROⅤEAN生物信息學軟件進行蛋白功能預測。同時根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（ACMG）2015年發(fā)布的基因變異解讀標準和指南進行變異致病性分析。

1.2.8 變異位點的氨基酸保守性分析 并用Clustal Omega軟件分析突變位點蛋白質(zhì)序列的保守性。

1.2.9 變異蛋白空間結(jié)構(gòu)模型分析 針對變異位點用Alpha Fold 2（https://alphafold.ebi.ac.uk）對CDAN1 的結(jié)構(gòu)進行建模，預測錯義突變前后對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，采用PyMOL 2.3software對蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 先證者主要臨床特征

臨床超聲提示：全身皮下廣泛水腫，胸腹腔積液，肝脾增大，胎盤增厚，心包缺損，股骨、頭圍＜-2SD。引產(chǎn)后胎兒組織可見胎兒水腫（圖1A）其他相關檢查：孕婦22周歲，Rh（D）血型陽性，不規(guī)則抗體陰性，血常規(guī)結(jié)果正常，胎兒腹水常規(guī)正常，排除常見免疫性貧血所致胎兒水腫的可能。胎兒父母非近親結(jié)婚且表型正常，孕期無用藥史或不良環(huán)境接觸史。

2.2 羊水細胞培養(yǎng)和G顯帶核型分析

46，XY，未發(fā)現(xiàn)異常核型。

2.3 全基因組拷貝數(shù)變異測序

檢測范圍內(nèi)未見明顯異常。

2.4 全外顯子組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

全外顯子組雙向測序目標捕獲區(qū)平均測序深度為163.51×，測序目標區(qū)域覆蓋度為99.90%，目標區(qū)域捕獲均一性為為93.85%，覆蓋30×以上區(qū)域占比為94.40%，Q30為94.40%。設計質(zhì)量符合實驗設計要求。

2.5 基因檢測結(jié)果

測序數(shù)據(jù)經(jīng)dbSNP、Ex AC和1000 Genomes數(shù)據(jù)庫的過濾篩選后，發(fā)現(xiàn)了胎兒組織15 號染色體上的CDAN1基因（NM_138477.4）存在兩個突變，經(jīng)父母數(shù)據(jù)比對確認為復合雜合突變。包括8號外顯子上的移碼突變c.1264_1265delCT（p.Leu422Glyfs*16），和14號外顯子上的錯義突變c.2140C＞T（p.Arg714Trp）（圖1B，表1）。

表1 先證者家系CDAN1基因突變位點Tab.1 Mutation site of CDAN1 gene in the proband's family

圖1 家系CDAN1基因結(jié)果Fig.1 Gene sequencing result of the proband's family.A:Abnormal subcutaneous edema,ascites,pleural effusion of the affected individuals.B:Pedigree of the family's CDAN1 variations in the proband's family.C:Sanger sequencing revealed that the variation occurred at the c.2140 and c.1264_1265 sites in CDAN1 gene.The heterozygous mutations of the family at positions c.2140C＞T and c.1264_1265delCT.

2.6 變異位點的致病性分析

CDAN1 基因14 號外顯子上的雜合錯義突變c.2140C＞T，可導致其編碼的第714 位氨基酸精氨酸（Arg）被色氨酸（Trp）取代，Clustal Omega軟件分析該位點編碼的第714位氨基酸在人類、鼠、長臂猿、猴、牛、豬、馬、犬、大熊貓的物種進化過程中均高度保守（圖2A）。PolyPhen-2、I-Mutant v2.0、Mutation Taster 和PROⅤEAN等生物信息學預測其編碼蛋白有害或降解（表2）。蛋白模型分析顯示p.Arg714Trp變異后，取代后的氨基酸之間的氫鍵和疏水作用力改變，致使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（圖2B）。該變異在ClinⅤar數(shù)據(jù)庫中記錄為可能致病性，在HGMD數(shù)據(jù)庫中記錄為致病性。在ExAC數(shù)據(jù)庫正常對照人群頻率為0.0000417，在gnomAD 數(shù)據(jù)庫正常對照人群中頻率為0.00007569。有文獻報道［1,9-11］，在先天性紅細胞生成障礙性貧血1型患者中檢測到該變異與其他可能致病性或臨床意義未明變異構(gòu)成復合雜合突變結(jié)合已知致病性證據(jù)，根據(jù)ACMG遺傳變異分類標準，判斷該變異為可能致病性（PM2+PM3+PS3_Supporting+PP3）。

表2 生物信息學預測CDAN1基因c.2140C＞T位點的致病性Tab.2 In silico analysis for predicting the pathogenicity of site c.2140C＞T

CDAN1 基因8 號外顯子上的雜合移碼突變c.1264_1265delCT，導致蛋白編碼在第422 位亮氨酸（Leu）由甘氨酸（Gly）取代，并在隨后15位提前出現(xiàn)氨基酸的終止密碼，變異截短大于10%的蛋白質(zhì)，可能發(fā)生NMD（Nonsense-mediated mRNA decay）導致蛋白功能受損，AutoPⅤS1等生物信息學預測其編碼蛋白有害。蛋白模型分析顯示變異后，形成了截短的CDAN1蛋白質(zhì)（圖2C）。該變異在ClinⅤar數(shù)據(jù)庫和HGMD數(shù)據(jù)庫中暫無記錄，在ExAC數(shù)據(jù)庫正常對照人群頻率為0.000008237，在gnomAD數(shù)據(jù)庫正常對照人群頻率為0.000003976，根據(jù)ACMG遺傳變異分類標準，判斷該變異為可能致病性（PⅤS1+PM2）。

圖2 生物信息學預測和蛋白3D結(jié)構(gòu)可視化Fig.2 Bioinformatics and three-dimensional protein structure visualization.A:Conservative analysis of amino acid site 714 of Codanin-1 protein.B:The structure of Codanin-1 is modeled to predict the effect of missense mutations on protein structure using Alpha Fold 2.Arrow on the left shows the location of amino acid site 714,and the hydrogen bonds and hydrophobic forces between the amino acids and changes in protein spatial structure are shown on the right.Blue dotted lines are hydrogen bond interactions,and yellow dotted lines are hydrophobic interactions.C:Prediction diagram of truncated Codanin-1 protein model.

2.7 Sanger測序驗證分析

對該家系成員3人CDAN1基因進行Sanger測序驗證，先證者（Ⅱ1）c.2140C＞T/c.1264_1265delCT 復合雜合突變，其父（I1）為c.2140C＞T/WT雜合突變，其母（I2）為c.1264_1265delCT雜合突變，與WES結(jié)果一致（圖1C）。

3 討論

胎兒水腫（HF）發(fā)病率是1/1700到1/3000，當胎兒有至少兩個不同部位的液體積聚時，可診斷為胎兒水腫［12］。隨著抗Rh（D）免疫球蛋白的臨床應用，免疫性水腫的比例已明顯下降，非免疫性水腫（NIHF）所占比例逐漸升高。然而，由于NIHF的病因復雜且臨床預后較差，大部分致病原因和致病機制仍不清楚，其發(fā)病率、死亡率和復發(fā)風險因病因的不同而有很大差異。因此，對遺傳學病因的確定，有益于臨床醫(yī)生對疾病的預后判斷、復發(fā)風險評估和遺傳咨詢［2,13,14］。我們的研究結(jié)果說明，當NIHF排除染色體非整倍體和拷貝數(shù)變異的因素后，全外顯子測序技術將是一種可行且有效的分子診斷方法。

先天性紅細胞生成障礙性貧血（CDA）是一種非常罕見的遺傳病，該病的特征為成紅細胞形態(tài)異常，紅細胞無效生成，大細胞貧血，部分患者可表現(xiàn)為骨骼發(fā)育異常、指甲發(fā)育不全和脊柱側(cè)彎。由于統(tǒng)計樣本量、種族和基因診斷能力的差異，目前該疾病的總?cè)巳喊l(fā)病率暫不清楚。目前，未見基于中國人群的發(fā)病率統(tǒng)計和系統(tǒng)性研究［15］。CDA的臨床癥狀異質(zhì)性比較大，從無癥狀者到重度貧血均可出現(xiàn)。有些亞型，如CDAⅡ型容易被誤診為其他類型的貧血或由于國家發(fā)展程度和機構(gòu)檢測能力的差異而未被發(fā)現(xiàn)。值得指出的是，雖然通過光學顯微鏡和骨髓穿刺等傳統(tǒng)技術手段可以診斷CDA，但卻不能將CDA的亞型進行很好的區(qū)分，因此全外顯子測序可作為一種創(chuàng)傷小而操作性強的替代方法［5,16］。

CDAN1基因的28個外顯子位于染色體15q15，跨越基因組1.5 kb，編碼含有1227個氨基酸的codanin-1蛋白，該蛋白是一種O-糖基化蛋白，可能與核膜完整性、微管附著有關［11,17］。CDAN1基因突變最常見于新生兒和青少年。在新生兒期臨床表現(xiàn)為肝臟腫大、早期黃疸和宮內(nèi)生長遲緩，在青少年期，大多數(shù)受累者終身伴有中度至重度貧血，通常伴有黃疸、脾腫大和膽結(jié)石，部分存在脊柱側(cè)凸和四肢畸形［1,6,8,17-19］。僅有極少數(shù)病例報道了妊娠期的胎兒水腫，且除兩篇報道外，大多研究報道均未行相關基因檢測，僅根據(jù)外周血象和骨髓穿刺結(jié)果進行了臨床確診［20-23］。2019年新加坡的一篇研究發(fā)現(xiàn)了一例患胎在孕19周被診斷為胎兒水腫，表現(xiàn)為肝脾腫大、腹水、胎盤增厚、四肢發(fā)育落后和心包積液伴心臟擴大［9］，隨后，該研究者檢測出CDAN1基因c.1744C＞Tp.Q582*和c.2140C＞T復合雜合。該胎兒在宮內(nèi)多次輸血治療，最終在出生后5個月死于多器官功能衰竭和膿毒血癥。上述病例與本研究的患胎均攜帶了同樣的c.2140C＞T錯義突變，和突變位點不同的移碼突變——前者為c.1744C＞T，本例為c.1264_1265delCT，為國內(nèi)外首次報道的突變，可能因產(chǎn)生了截短蛋白而影響蛋白質(zhì)功能，因此，在臨床癥狀上有相似的表現(xiàn)——均在中孕期發(fā)生了明顯的胎兒水腫等一系列表型。這提示了我們可根據(jù)突變類型和突變位點對患兒愈后作出一定程度的預判。

Liu等［20］報道了一例中國患胎在孕22周B超發(fā)現(xiàn)胎兒水腫、腹水伴心臟擴大，胎兒大腦中動脈收縮期峰值流速（MCA-PSⅤ）升高，臍血穿刺檢測提示胎兒嚴重貧血（Hb 6.5 g/dL），WES檢測出CDAN1基因c.2059C＞T（p.R687C）純合突變，最終孕婦決定終止妊娠。該病例與本研究病例表現(xiàn)型相似，且均未發(fā)現(xiàn)胎兒四肢結(jié)構(gòu)異常，本研究病例由于胎兒孕周較小臍帶細，未能抽取臍血行相關血液學檢測。

目前，已在多名CDA 患者中檢出c.2140C＞T（R714W）突變，研究表明該區(qū)域位于CpG島上，被認為是CDAN1的突變熱點區(qū)域［1,17,24］，且目前已報道的致病性突變多集中在12-24號外顯子上，提示該區(qū)域突變可能導致更嚴重的臨床癥狀［24］。

然而，CDAN1基因突變類型和臨床嚴重程度的相關性仍不清楚，本研究暫時無法解釋部分兒童患者脊柱側(cè)凸、四肢畸形和指甲發(fā)育不全的原因和機制，且多數(shù)報道由于當時檢測方法所限，均未行全外顯子組測序，或僅檢測了CDAN1基因，是否存在其他共效基因影響患者臨床表型，有待進一步研究。

綜上，通過家系全外顯子組測序方法，我們對一例不明原因的胎兒期非免疫性水腫家系進行遺傳學分析，發(fā)現(xiàn)了CDAN1基因c.2140C＞T/c.1264_1265delCT復合雜合突變。本研究首次報道了CDAN1基因8號外顯子的一個新的突變，豐富了CDA致病基因的突變列表，及其在妊娠期胎兒水腫綜合征中發(fā)揮的作用，同時加深了我們對該基因表現(xiàn)型和個體表現(xiàn)度差異性的認識，為該家系的遺傳咨詢、生育指導提供相應理論支持。