右美托咪定預(yù)處理通過(guò)抑制NLRP3 炎性小體激活減輕大鼠腸缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷

韓 冰，陳夢(mèng)婷，楊傳銘，李曉紅

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 蚌埠233000

腸缺血再灌注（II/R）損傷是一種常見(jiàn)的威脅生命 的并發(fā)癥，可在多種臨床條件下發(fā)生，如動(dòng)脈栓塞、絞窄性疝、結(jié)腸癌、腸扭轉(zhuǎn)、毒血癥、腸系膜功能障礙和低血容量性休克等［1］。II/R不僅損傷局部腸道本身，還可引發(fā)遠(yuǎn)端器官功能障礙，特別是急性肺損傷（ALI）［2］。過(guò)度的炎癥反應(yīng)是II/R所致ALI的一個(gè)顯著特征，表現(xiàn)為缺血腸組織釋放促炎細(xì)胞因子、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)菌源性內(nèi)毒素［3-4］。因此，針對(duì)II/R 期間肺損傷，抑制炎癥反應(yīng)過(guò)度勢(shì)在必行。近年來(lái)核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體研究最為廣泛，其在免疫反應(yīng)和疾病發(fā)展過(guò)程中起著重要作用［5］。相關(guān)研究指出，其通過(guò)激活caspase-1以促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β/18（IL-1β/18）的表達(dá)、處理和釋放，導(dǎo)致炎癥和組織損傷［6］。II/R可刺激腸道脂質(zhì)介質(zhì)釋放，增強(qiáng)NLRP3炎性小體的激活及隨后炎性因子的產(chǎn)生，增加肺血管通透性和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致ALI［7］。提示對(duì)NLRP3炎性小體干預(yù)可能成為治療II/R所致ALI的潛在措施。由于其鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，右美托咪定（Dex）主要在重癥監(jiān)護(hù)和麻醉期間使用［8］。研究表明，Dex可以減輕大鼠腸缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷［9］。另有研究指出，Dex與NLRP3炎性小體的活性抑制有關(guān)［10］。但Dex減輕II/R所致的肺損傷是否與NLRP3炎性小體相關(guān)，尚不清楚。因此，本研究擬探討Dex 對(duì)II/R 誘導(dǎo)的肺損傷的影響，并確定其保護(hù)作用是否與NLRP3炎性小體相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量220～250 g，8～12周齡，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則進(jìn)行。

1.2 試劑

右美托咪定（批號(hào)：H20183219，揚(yáng)子江藥業(yè)），RIPA裂解液、PMSF（Beyotime）公司，BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime），髓過(guò)氧化物酶（MPO）測(cè)試盒（南京建成）TNF-α、IL-18、IL-1β ELISA試劑盒（R&D，USA），NLRP3 抗體（Novus，USA），caspase-1 和ASC 抗體（Santa，USA），腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和p-AMPK抗體（CST，USA），GAPDH抗體（Abcam,，UK），小鼠抗兔及抗小鼠二抗（Santa，USA）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備和分組

參照文獻(xiàn)［9］腸缺血再灌注損傷模型制備方法。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉大鼠，采取夾閉腸系膜上動(dòng)脈（SMA）1 h，然后解除夾閉再灌注2 h建立大鼠腸缺血再灌注損傷模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為4組，8只/組。假手術(shù)組（Sham組）：暴露SMA，但不夾閉SMA；腸缺血再灌注組（II/R組）：阻斷SMA 1 h后再灌注2 h；Dex+腸缺血再灌注組（Dex+II/R組）：松開(kāi)鉗夾之前腹腔注射Dex 25 μg/kg［11-13］；Dex假手術(shù)組（Dex組）:假手術(shù)組腹腔注射Dex 25 μg/kg。Sham組及II/R組腹腔內(nèi)注射等量的生理鹽水。深麻醉下處死大鼠，取材放于-80 ℃保存，后續(xù)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4 肺組織濕/干質(zhì)量比值（W/D）測(cè)定

取左肺上葉組織，用濾紙吸去表面液體，用電子天平準(zhǔn)確稱量以確定濕質(zhì)量（W）。然后在70 ℃的烘箱中鼓風(fēng)干燥24 h，待組織恒重后準(zhǔn)確稱量確定干質(zhì)量（D）。計(jì)算左肺上葉組織W/D值。

1.5 肺組織病理學(xué)評(píng)估

取右肺上葉組織，用4%多聚甲醛在4 ℃下固定24 h，在連續(xù)濃度的乙醇-水溶液中脫水，室溫下石蠟包埋切片，收集4 μm厚的石蠟切片，行HE染色，光鏡下分析肺組織病理改變，并對(duì)肺損傷嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估［14］：0（正常組織）、1（炎癥變化極小）、2（輕中度炎癥改變-肺泡結(jié)構(gòu)無(wú)明顯損傷）、3（中度炎性損傷-肺泡間隔增厚）、4（中度至重度炎性損傷-形成扭曲正常結(jié)構(gòu)的肺炎結(jié)節(jié)或區(qū)域）、5（嚴(yán)重的炎癥性損傷-肺泡結(jié)構(gòu)完全消失）。

1.6 肺組織中MPO活性測(cè)定

取一定量的肺組織，在冰上用勻漿器充分勻漿。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。MPO活性是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的一個(gè)指標(biāo)，以每克組織濕重為單位表示（U/g）。

1.7 ELISA檢測(cè)肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-18的含量

肺組織用冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS；0.01 mol/L，pH=7.4）沖洗，去除表面的血液。組織稱重，切成小塊，在冰上用勻漿器充分勻漿，在4 ℃以4000×g離心10 min獲取上清液。用ELISA法檢測(cè)肺組織中IL-18、TNF-α、IL-1β含量。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1、p-AMPK、AMPK蛋白水平檢測(cè)

肺組織在含1%PMSF的RIPA裂解緩沖液中勻漿，在4 ℃以13 000×g、離心15 min，取勻漿上清液在4 ℃以10 000×g離心10 min，留取上清液。用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。用一定濃度的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，隨后電轉(zhuǎn)移到PⅤDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，之后分別加入一抗NLRP3（1∶1000，sc06-23）、caspase-1（1∶200，sc-392736）、ASC（1∶200，sc-514414）、p-AMPK及AMPK（1∶1000，#2531/#2532），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，10 min/次。然后與抗兔免疫球蛋白G（IgG）-HRP（sc-2357）或抗小鼠IgG-HRP（sc-516102）二抗（1∶2000；Santa Cruz Biotechnology，Inc）。室溫孵育1 h。同以上方法洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Beyotime，中國(guó)）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化處理，Image J軟件分析蛋白條帶，測(cè)定灰度值。GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。目的蛋白與內(nèi)參灰度值之比表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述計(jì)量資料，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dex對(duì)II/R大鼠肺組織W/D值的影響

與Sham組相比，II/R組大鼠肺組織W/D 比值顯著增加（P＜0.05）；與II/R組相比，Dex+II/R組大鼠肺組織W/D值明顯下降（P＜0.05）；Sham組與Dex組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織濕/干重比值Fig.1 Wet/dry weight ratio of the lung tissue in each group.*P＜0.05,#P＜0.05 vs Sham group.

2.2 Dex對(duì)II/R大鼠肺組織病理改變的影響

Sham組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無(wú)明顯滲出。Dex組肺泡結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯變化。然而，II/R組肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破壞，肺泡破裂、滲出、出血以及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)顯著增厚，肺泡腔融合。相比之下，Dex+II/R組表現(xiàn)出相對(duì)輕微的肺損傷，肺泡內(nèi)滲出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔均較II/R組輕（圖2）。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化Fig.2 Pathological changes in the lung tissue in each group(HE staining,original magnification:×200).

光學(xué)顯微鏡下對(duì)各組肺組織切片觀察，計(jì)算肺損傷評(píng)分以指示肺病理改變。II/R組的肺損傷評(píng)分明顯高于Sham組。與II/R組相比，Dex+II/R組則表現(xiàn)出較低的肺損傷評(píng)分（圖3）。

2.3 Dex對(duì)II/R大鼠肺組織中MPO活性的影響

與Sham組相比，II/R組肺組織中MPO水平顯著升高（P＜0.05）；與II/R 組相比，Dex+II/R組肺組織中MPO水平明顯降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 各組大鼠肺組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性Fig.4 Myeloperoxidase (MPO) activity in the lung tissues in each group.*P＜0.05,#P＜0.05 vs Sham group.

2.4 Dex對(duì)II/R大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)的影響

與Sham 組相比，II/R 組肺組織中IL-1β、IL-18、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與II/R 組相比，Dex+II/R組肺組織中IL-1β、IL-18、TNF-α的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。Sham組和Dex組相比，大鼠肺組織中IL-1β、IL-18、TNF-α表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-18表達(dá)水平比較Fig.5 Comparison of IL-1β (A),IL-18 (B) and TNF-α (C) expression levels in the lung tissues among the 4 groups.*P＜0.05,#P＜0.05 vs Sham group.

2.5 Dex對(duì)II/R大鼠肺組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)的影響

與Sham 組相比，II/R 組大鼠肺組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與II/R 組相比，Dex+II/R 組肺組織中NLRP3、ASC 和caspase-1蛋白表達(dá)水平下降明顯（P＜0.05，圖6）。

圖6 各組大鼠肺組織中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)情況Fig.6 Expression of NLRP3,ASC and caspase-1 protein in the lung tissue in each group.A:Western blots of NLRP3,ASC and caspase-1.B:Relative expression level of NLRP3.C:Relative expression level of caspase-1.D:Relative expression level of ASC.*P＜0.05,#P＜0.05 vs Sham group.

2.6 Dex對(duì)II/R大鼠肺組織中p-AMPK蛋白表達(dá)的影響

與Sham組相比，II/R組大鼠肺組織中p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；與II/R組相比，Dex+II/R組肺組織中p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05，圖7）。

圖7 各組大鼠肺組織中p-AMPK蛋白表達(dá)情況Fig.7 Expression of p-AMPK protein in the lung tissues in each group.A:Western blots of p-AMPK and AMPK.B:Relative expression level of p-AMPK.*P＜0.05,#P＜0.05 vs Sham group.

3 討論

II/R損傷具有較高的發(fā)病率和死亡率［15］，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、促炎細(xì)胞因子釋放、氧化應(yīng)激、反應(yīng)性氮物質(zhì)的產(chǎn)生、腸屏障破壞和細(xì)菌移位等［16］。除了對(duì)腸道的局部損傷外，還可導(dǎo)致血液中促炎介質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害遠(yuǎn)端器官，最易引起ALI［2］。研究表明，促炎細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞的過(guò)度升高在ALI發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［17］。本研究采用SMA夾閉1 h再灌注2 h制備大鼠II/R模型。結(jié)果表明：同Sham組相比，II/R組大鼠肺組織損傷明顯，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，肺間質(zhì)顯著增寬，肺組織W/D值及損傷評(píng)分顯著升高。提示II/R誘導(dǎo)的ALI模型構(gòu)建成功。

促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6以及IL-1β釋放，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮誘發(fā)肺水腫是ALI的重要特征［18］。故而，炎癥失控可能是ALI的核心問(wèn)題［17］。有研究顯示，II/R誘導(dǎo)的ALI可通過(guò)激活炎性細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子［19］，誘導(dǎo)微循環(huán)障礙、集聚更多炎性細(xì)胞、加重細(xì)胞凋亡從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。因此，可通過(guò)抗炎治療減輕II/R 所致的ALI。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同Sham 組大鼠相比，II/R 組大鼠肺組織中MPO 活性、TNF-α及IL-1β水平明顯升高。同時(shí)，與II/R組相比，Dex+II/R組肺部組織的病理?yè)p傷相對(duì)輕微，肺組織W/D值及損傷評(píng)分明顯下降，肺組織中MPO活性、TNF-α及IL-1β水平下降顯著。這表明Dex通過(guò)減少I(mǎi)L-1β、TNF-α的表達(dá)及降低中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕肺組織炎癥，從而改善II/R誘導(dǎo)的ALI。

NLRP3炎性小體在炎癥機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20］。當(dāng)傷害性刺激產(chǎn)生時(shí)，NLRP3被激活，集聚ASC，反過(guò)來(lái)激活caspase-1，促使pro-IL-1β、pro-IL-18轉(zhuǎn)變?yōu)镮L-1β、IL-18［21，22］，導(dǎo)致組織損傷。此外，NLRP3炎性小體被認(rèn)為是肺部炎癥性疾病中最重要的因素之一［23］，且在ALI中起關(guān)鍵作用［24］。II/R后，NLRP3炎性小體在心、肝、腎、肺、腸等器官的早期損傷中發(fā)揮重要作用［25］。有研究指出，II/R誘導(dǎo)的ALI是通過(guò)NLRP3炎性小體介導(dǎo)的［7］。因此，NLRP3炎性小體可能是治療II/R 所致ALI的有效靶點(diǎn)。本結(jié)果顯示，相較于Sham組，II/R組肺部組織的損傷相對(duì)嚴(yán)重，肺組織中IL-18、IL-1β表達(dá)顯著升高，肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)明顯升高。這表明NLRP3炎性小體在II/R所致的ALI中活性增強(qiáng)，激活caspase-1促使IL-18、IL-1β等促炎細(xì)胞因子成熟、分泌，從而介導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)誘發(fā)ALI。

Dex是一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，在臨床麻醉和重癥監(jiān)護(hù)病房中應(yīng)用廣泛［8］。很多證據(jù)表明，Dex可通過(guò)抑制一系列疾病的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)包括肺部在內(nèi)的各種器官［10,26，27］。Dex與抑制NLRP3炎性小體的活性有關(guān)［10］。Dex可以抑制NF-κB途徑和NLRP3炎性小體，從而抑制炎癥反應(yīng)［28，29］。本結(jié)果表明，同II/R組相比，Dex+II/R組肺組織的損傷顯著減輕，肺組織中TNF-α、IL-18、IL-1β表達(dá)明顯下降，肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)減少。Dex可能通過(guò)對(duì)NLRP3炎性小體活性的抑制，進(jìn)而抑制IL-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕肺部組織的炎性反應(yīng)，從而改善ALI。

AMPK是調(diào)控細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶。AMPK軸是NLRP3炎性小體激活的調(diào)節(jié)因子［30］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)評(píng)估磷酸化的AMPK來(lái)評(píng)價(jià)Dex對(duì)AMPK激活的影響。結(jié)果顯示，相較于Sham組，II/R組大鼠肺組織中p-AMPK蛋白表達(dá)明顯下降，NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)增加；相較于II/R 組，Dex+II/R 組肺組織中p-AMPK蛋白表達(dá)明顯升高，NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)下降。表明Dex可通過(guò)抑制AMPK失活，進(jìn)而對(duì)NLRP3炎性小體的激活起抑制作用。

綜上所述，Dex可改善大鼠II/R所致ALI，可能是通過(guò)改善AMPK軸對(duì)NLRP3炎性小體激活起抑制作用，進(jìn)而抑制caspase-1的激活及其下游炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-18的表達(dá)、分泌，減輕肺部炎癥損傷。這些結(jié)果證實(shí)，Dex 治療可能有助于對(duì)大鼠II/R所致ALI 發(fā)揮保護(hù)作用。