表達(dá)高親和PD-1 突變體和嵌合抗原受體的雙效CBNK 細(xì)胞的構(gòu)建及其生物學(xué)特性評價

鐘慧霖，鄒慶劍，劉海霞，王曉民，杜少茵，梁海燕，吳志君，葉俊杰，鄒清雁

1廣州熙帝生物科技有限公司，廣東 廣州 510633；2五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院，廣東 江門 529020；3西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310024

近年來，嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）細(xì)胞治療在血液瘤中取得了很好的療效，特別是CD19 CAR-T細(xì)胞對急性淋巴細(xì)胞白血病的治療達(dá)到了70%～90%的完全緩解率［1］。2017～2018年，美國FDA和歐洲EMA分別批準(zhǔn)了兩個白血病及淋巴瘤的CAR-T細(xì)胞治療藥物Kymriah?and Yescarta?上市。然而，CAR-T療法的缺陷及副作用至今仍未能夠得到很好的解決，例如患者自體來源的細(xì)胞制備CAR-T的成功率低、活性不高且需要較長時間而異體來源又存在移植物抗宿主病風(fēng)險，細(xì)胞因子風(fēng)暴和神經(jīng)毒性［2］以及其它副作用如發(fā)熱，中性粒細(xì)胞減少，低血壓，紅細(xì)胞減少，感染，腫瘤溶解綜合癥等［3］，為了解決這一問題，研究者將研究方向轉(zhuǎn)向不具備移植物抗宿主病及細(xì)胞因子風(fēng)暴的自然殺傷（NK）細(xì)胞，目前已有多項CD19-CAR-CBNK臨床試驗正在進(jìn)行。

NK細(xì)胞識別和殺傷感染或腫瘤細(xì)胞無人類淋巴細(xì)胞抗原限制且不需要預(yù)先激活［4］。NK細(xì)胞在體內(nèi)存活時間較短暫，對機(jī)體原有免疫系統(tǒng)的干擾較小［5］，無發(fā)生移植物抗宿主病風(fēng)險［6］，一般不會引起細(xì)胞因子風(fēng)暴［7-9］，這使NK細(xì)胞可以有望制備成“貨架產(chǎn)品”供腫瘤患者選擇應(yīng)用。另外，NK細(xì)胞來源豐富，可從外周血、異體外周血、臍血分離獲得，或是從多能干細(xì)胞分化獲得，或者功能性細(xì)胞系NK-92。這些NK細(xì)胞成為了CAR療法的極具潛力的細(xì)胞來源［10］。臍血中含有比外周血更高比例的NK細(xì)胞［11］，來源豐富且個體差異較?。?2］，更易于質(zhì)量控制。并且臍血NK（CBNK）細(xì)胞更易于擴(kuò)增且所擴(kuò)增的CBNK細(xì)胞存活率較高［13］。

表達(dá)程序性細(xì)胞死亡配體（PD-L1）是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫攻擊的一個關(guān)鍵手段。PD-L1 通常用于通過結(jié)合程序性死亡受體（PD-1）來防止自身免疫攻擊，PD-1通常表達(dá)于激活的T細(xì)胞及部分NK細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞［14］。在結(jié)合其配體PD-L1后，PD-1 通過胞內(nèi)信號啟動免疫抑制［15］。雖然在健康情況下PD-L1可阻止過多的及有害的炎癥，但在腫瘤狀態(tài)下，腫瘤及基質(zhì)PD-L1表達(dá)卻會使抗腫瘤淋巴細(xì)胞耗竭從而成為抗腫瘤障礙［16］。因此，PD-1、PD-L1 通路已成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵靶點，阻斷任何一方的單克隆抗體在一系列腫瘤中顯示出良好的抗腫瘤效力，哪怕是在進(jìn)展性及轉(zhuǎn)移性階段［17-21］。雖然效力明顯，但單克隆抗體在治療中具有特殊的缺陷。例如，PD-1表達(dá)的效應(yīng)T細(xì)胞可浸潤到PD-L1陽性實體瘤內(nèi)部［16］而抗體由于體積較大，不一定能夠浸潤到腫瘤內(nèi)部［22］。抗體的另外一個缺陷在于它們激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)的能力(ADCC/ADCP效應(yīng))較弱［23］?？鼓[瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面既表達(dá)PD-1 也表達(dá)PD-L1［24,25］。因此，這些抗體可能會消耗掉本應(yīng)激活的T淋巴細(xì)胞。研究表明，抗PD-1抗體治療后患者循環(huán)系統(tǒng)T細(xì)胞確實會減少［26］。為解決這一問題，有學(xué)者開發(fā)了一種高親和PD-1片段，其大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于單克隆抗體且不含有抗體Fc 部分，其在治療小鼠腫瘤模型中具有更好的療效［27］。

雖然目前的臍血CAR-CBNK細(xì)胞已經(jīng)大量研究并正在進(jìn)行臨床試驗，然而其療效卻仍有待提高［28］，可能與其對腫瘤細(xì)胞殺傷活性較弱及腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)PD-L1進(jìn)行免疫逃逸相關(guān)，而在CAR中插入PD-1抗體片段卻又因為其片段過大影響感染效率以及細(xì)胞浸潤腫瘤內(nèi)部的能力［22］。因此，本研究目的是構(gòu)建一種同時表達(dá)工程化高親和PD-1（HAPD1）和CAR 的雙效CBNK細(xì)胞，并在體外檢測其擴(kuò)增能力、感染效率、細(xì)胞亞群分析以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力等生物學(xué)特性，驗證抗腫瘤能力其成藥可行性。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、載體、實驗動物

Naml6、293T腫瘤細(xì)胞株（中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈）；臍血來源于江門市五邑中醫(yī)院，經(jīng)該醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并與產(chǎn)婦簽訂臍帶血捐獻(xiàn)知情同意書。載體pWPXLdLuciferase-EGFP、Pltr-FMC63-28-41BB-CD3ζ（Pltr-CAR19）、Pltr-EGFP-2a-FMC63-28-41BB-CD3ζ（Pltr-EGFP-CAR19）、pspax2、pMD2.G等由本實驗室前期構(gòu)建及保存。NPG免疫缺陷小鼠（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Ⅴst）購自上海南方模式生物科技股份有限公司（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2019-0002），體質(zhì)量15～20 g。所有動物實驗方案均經(jīng)中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動物倫理委員會批準(zhǔn)，所有實驗都是按照實驗動物護(hù)理和使用指南（IACUC）進(jìn)行。

1.2 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA回收試劑盒（北京天根生化科技公司），DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶（TAKARA），胎牛血清、DMEM（Hyclone），臍血單個核細(xì)胞分離液（本公司專利產(chǎn)品、自配）、慢病毒包裝試劑盒（本公司產(chǎn)品：CD-LⅤP-02）、NK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增試劑盒（友康生物）、PBS、DMSO（Invitrogen）。所用引物及合成基因由艾基生物根據(jù)設(shè)計合成。

1.3 基因合成

工程化高親和PD-1 蛋白突變體的來源參考文獻(xiàn)［27］，蛋白包含經(jīng)過改造的PD-1胞外區(qū)和跨膜區(qū)，我們根據(jù)蛋白序列，在合成其表達(dá)基因，其序列如下：

ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTC GTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCC AGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTG GAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGT GGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCT GCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCCACG TGATCTGGCACCGCGAGAGCCCCAGCGGCCAG ACGGACACACTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCG CAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTG TCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCAC ATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAG CGGCACCTACGTGTGTGGGGTGATCTCCCTGGC CCCCAAGATTCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGG CAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGA AGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCA GGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTT GGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGT GCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTGCTC CCGGGCCGCACGAGGGACAATAGGAGCCAGGC GCACCGGCTAG）

按以下設(shè)計合成兩對引物

CAR119-F：agaggatctatttccggtgaa；

CAR19-R:

gtgggatctgcataGGTCCGGGGTTCTCTTCCAC

HAPD1-F:GGACCtatgcagatcccacag

HAPD1-R:cagaggttgattgttccagacgcgtttaCTAgccgg

1.4 載體構(gòu)建

原載體Pltr-CAR19用EcoRI/Mlul酶切，然后以酶切產(chǎn)物為模板用引物CAR19-F和CAR19-R通過PCR擴(kuò)增出CAR19 片段；合成的基因用HAPD1-F 及HAPD1-R引物擴(kuò)增出HAPD1片段；然后兩個擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行重組連接。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化top10大腸桿菌擴(kuò)增，提質(zhì)粒酶切鑒定并送公司測序，比對測序結(jié)果，將測序正確無突變的質(zhì)粒即為表達(dá)高親和PD-1的CAR載體Pltr-CAR19-2a-HAPD1。另外用相同的方法構(gòu)建含有熒光標(biāo)記的同種載體Pltr-EGFP-2a-CAR19-2a-HAPD1。

1.5 慢病毒包裝與滴度檢測

質(zhì)粒準(zhǔn)備：提取質(zhì)粒pWPXLd-Luciferase-EGFP、Pltr-CAR19、Pltr-EGFP-2a-CAR19、Pltr-CAR19-2a-HAPD1、Pltr-EGFP-2a-CAR19-2a-HAPD1、pspax2、PMD2G（經(jīng)檢測要求質(zhì)粒無菌、無內(nèi)毒素、260/280在1.8～2.0）。

細(xì)胞準(zhǔn)備：復(fù)蘇8代以內(nèi)的293T細(xì)胞傳兩代后以轉(zhuǎn)染前1 d接種至10 cm皿，次日觀察細(xì)胞密度在70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1～2 h換液（細(xì)胞要求無支原體污染）。

轉(zhuǎn)染：取8μg目的質(zhì)粒加入到A液（1 mL/管）中混勻靜置5 min，再加入B液（100μL），立即用力混勻，室溫靜置15～20 min。將以上混合液直接滴加到細(xì)胞培養(yǎng)表面，輕輕搖勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～14 h后換上含2%～5%血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

收獲病毒：轉(zhuǎn)染60～72 h收集細(xì)胞上清，800 g，10 min離心取上清，0.45μm過濾，以清除細(xì)胞碎片及其它雜質(zhì)。

濃縮：30 000 r/min，2 h，4 ℃超速離心，加1 mL培養(yǎng)基重懸過夜，按每次使用量分裝，-80 ℃保存。

滴度測定：將293T細(xì)胞密度調(diào)整為105/mL，接種至96孔板，100μL/孔，培養(yǎng)24 h。加入梯度體積的病毒液（0.001～10μL）。37 ℃培養(yǎng)過夜。次日換液，感染3 d在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y，則滴度（TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μL）。

1.6 分離臍血單個核細(xì)胞

用一次性采血袋采集臍血后快速于冰上運輸至細(xì)胞分離室，經(jīng)傳染病8項檢測合格后進(jìn)行分離。將備注導(dǎo)入含有等體積DMEM/F12的50 mL離心管混勻，然后小心吸至含有15 mL分離液表面，30 mL/管；然后離心800 g，20 min。離心完成后吸取中央白色層細(xì)胞即為臍血單個核細(xì)胞，加DMEM/F12洗滌2次后用于后續(xù)CBNK細(xì)胞培養(yǎng)。

1.7 擴(kuò)增CBNK細(xì)胞

將上一步中獲取的臍血單個核細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液裂解，洗滌兩次后使用NK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增試劑盒（友康生物）進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增，詳細(xì)操作如下：第0天：使用因子YC00A包被T75瓶2 h，取108上述單個核細(xì)胞接種至包被的T75 培養(yǎng)瓶，添加25 mL 培養(yǎng)基、細(xì)胞因子YC00B以及3 mL血漿，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第3天：補(bǔ)加25 mL培養(yǎng)基，添加細(xì)胞因子YC00C以及3 mL血漿；第5天：補(bǔ)加50 mL培養(yǎng)基，添加細(xì)胞因子YC00D以及3 mL血漿；將細(xì)胞轉(zhuǎn)至T175瓶培養(yǎng)；第7天：取樣計數(shù)，補(bǔ)加培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至106/mL，添加細(xì)胞因子YC00E以及5%血漿；將細(xì)胞轉(zhuǎn)至培養(yǎng)袋培養(yǎng)；隨后每2～3 d根據(jù)細(xì)胞密度進(jìn)行補(bǔ)液調(diào)整細(xì)胞密度至106/mL，第15天收獲細(xì)胞。

1.8 慢病毒感染CBNK細(xì)胞

按上一步所述步驟培養(yǎng)CBNK細(xì)胞至第3天早上往細(xì)胞中加入相關(guān)慢病毒（MOI=20∶1），隨后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h后換液，并按上一步所述方法添加相關(guān)細(xì)胞因子及培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4 d后取樣用血球計數(shù)板于熒光倒顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計算細(xì)胞感染效率。繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.9 細(xì)胞感染兩種CAR前后其增殖能力及表面標(biāo)志物檢測

培養(yǎng)3批臍血NK細(xì)胞，每批分非轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染普通CAR組以及轉(zhuǎn)染雙效CAR組；每次換液時記錄細(xì)胞增殖情況，擴(kuò)增至14 d后收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，分別檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD3、CD16、CD56、CD4、CD8表達(dá)情況，統(tǒng)計CD3-/CD16+CD56+、CD3+/CD16+CD56+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+細(xì)胞比例。

1.10 細(xì)胞體外殺傷活性檢測

熒光標(biāo)記靶細(xì)胞的制備：按步驟1.5所述的慢病毒包裝方法包裝pWPXLd-Luciferase-EGFP慢病毒并檢測其滴度。復(fù)蘇Naml6細(xì)胞株至92孔板（20 000/孔），用RPMI 1640+10%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，第2天加入pWPXLd-Luciferase-EGFP慢病毒（MOI=50∶1）。感染8 h后換液去除病毒，3 d后于熒光倒置顯微鏡下觀察。取約2000細(xì)胞稀釋至10 mL，混勻后分至96孔板各孔，于熒光倒置顯微鏡下觀察，選取明場計數(shù)與熒光計數(shù)一致的各孔細(xì)胞混合一起培養(yǎng)擴(kuò)增，獲得100%表達(dá)Luciferase-EGFP的Naml6細(xì)胞，即LucG-Naml6。

取適量培養(yǎng)中的LucG-Naml6細(xì)胞計數(shù)，然后加新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞密度密度調(diào)整為2×105/mL。取96孔板，每孔添加LucG-Naml6細(xì)胞。待檢測的CBNK細(xì)胞(CBNKs)、CD19-CAR CBNK細(xì)胞（CAR19-CBNKs）、雙效CAR-CBNK細(xì)胞（HAPD1-CAR19-CBNKs）按照實驗設(shè)計要求調(diào)整細(xì)胞密度，添加200μL。共培養(yǎng)24 h后將孔中細(xì)胞吹勻后吸到EP管，然后加300μL新培養(yǎng)基洗孔一次吸至同一EP管；所有各孔細(xì)胞吸完后離心500 g，5 min，吸棄上清，加40μL培養(yǎng)基重懸；然后吹勻后吸至血球計數(shù)板，熒光倒置顯微鏡下拍照（拍一張明場，4個計數(shù)室各拍一張綠光），計算細(xì)胞總數(shù)，綠色熒光細(xì)胞數(shù)（4個視野拍照計取平均值）。計算殺傷效率：

殺傷效率=1-（四視野熒光細(xì)胞數(shù)平均值/細(xì)胞總數(shù)×平均細(xì)胞總數(shù)）/（對照組熒光細(xì)胞數(shù)平均值/對照組細(xì)胞總數(shù)×對照組平均細(xì)胞總數(shù)）×100%

1.11 細(xì)胞殺傷活性與效靶比的關(guān)系檢測

按步驟1.6～1.8所述方法用同一份臍血制備普通CBNKs、傳統(tǒng)CAR19-CBNKs、新型雙效HAPD1-CAR19-CBNKs。在第15天收獲細(xì)胞，按照步驟3.7中所述方法分別以效靶比5∶1、10∶1、20∶1檢測這3種細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效率。

1.12 細(xì)胞殺傷活性與細(xì)胞收獲時間的關(guān)系檢測

按步驟1.6～1.8所述方法用同一份臍血制備普通CBNKs、傳統(tǒng)CAR19-CBNKs、HAPD1-CAR19-CBNKs。分別在第7、9、12、15天收獲細(xì)胞，按照步驟1.10中所述方法以效靶比10∶1檢測這3種細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效率。

1.13 CBNK細(xì)胞對Naml6移植瘤模型小鼠的影響

雌性NPG小鼠24只，15～20 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后尾靜脈注射LucG-Naml6細(xì)胞1×106/只。造模后第4天將模型小鼠隨機(jī)分成4組。A組：尾靜脈注射溶劑0.1 mL；B組：尾靜脈注射普通CBNK細(xì)胞5×106，0.1 mL；C組：尾靜脈注射普通CAR19-CBNK細(xì)胞5×106，0.1 mL；D組：尾靜脈注射HAPD1-CAR19-CBNK細(xì)胞5×106，0.1 mL。隨后每天觀察各組小鼠一般情況，在第14、21、28天眼眶采血紅細(xì)胞裂解液裂解后計數(shù)綠色熒光細(xì)胞比例（計數(shù)方法與體外殺傷試驗方法相同，若在此之前動物發(fā)病較嚴(yán)重則提前采血，仍按此時間點計算腫瘤細(xì)胞含量，已死亡則不統(tǒng)計）。第28天處死小鼠，觀察其主要臟器情況。

1.14 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。定量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒包裝與CBNK細(xì)胞的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

本研究采用本實驗室自制慢病毒包裝試劑盒包裝慢病毒，熒光質(zhì)?？筛咝мD(zhuǎn)導(dǎo)至293T細(xì)胞（圖1A），用梯度稀釋的未濃縮病毒感染293T檢測病毒滴度（圖1B），所包裝病毒濃縮前滴度約為1～2×106TU/mL，濃縮后滴度可達(dá)1×108TU/mL。傳統(tǒng)CAR19及HAPD1-CAR19對CBNK 細(xì)胞感染效率分別為20.39±1.37、18.63±1.88，HAPD1-CAR19感染效率略有下降但兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1 C、D）。

圖1 雙效載體系統(tǒng)具有高效的病毒包裝效率和NK細(xì)胞感染效率Fig.1 High packaging and infection efficiencies of the HAPD1-CAR19 lentiviral vector in cord blood NK cells.A:Lentiviral packaging of EGFP-CAR19 in 293T cells;B:Virus titer detected by infecting 293T with gradient diluted unconcentrated virus.The titer of the packaged virus before concentration was(1-2)×106 TU/mL;C,D:The infection efficiency was similar between traditional CAR19 and high affinity PD-1 CAR19(20.39±1.37 vs 18.63±1.88,P＞0.05;n=3).

2.2 CBNK細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

轉(zhuǎn)導(dǎo)高親和PD-1 CAR 的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)（10.97±2.77）和轉(zhuǎn)導(dǎo)傳統(tǒng)CAR細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)（13.48±2.71）小于未轉(zhuǎn)導(dǎo)的CBNK細(xì)胞（24.84±3.17，P＜0.05）；而兩種轉(zhuǎn)基因的CBNK細(xì)胞擴(kuò)增能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染第15天將所擴(kuò)增細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞中所含的各類細(xì)胞亞群的比例相似（P＞0.05，圖2B、C），細(xì)胞群中以NK細(xì)胞為主［（60.12±13.08）%］，另外還含有部分NKT細(xì)胞［（8.37±1.10）%］、CD4+T淋巴細(xì)胞［（19.51±7.83）%］及CD8+T淋巴細(xì)胞［（10.16±4.75）%］。

圖2 HAPD1-CAR19 CBNK細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞表面標(biāo)記檢測Fig.2 Proliferative ability and surface markers of HAPD1-CAR19 CBNKs.A:The proliferative ability was significantly lower in HAPD1-CAR19 CBNKs and CAR19-CBNKs than in uninfected CBNKs,but similar between the two infects cells (P＞0.05; n=3).B,C:Flow cytometry of the CBNKs(Day 15).There was no significant difference in the proportion of cell subsets in the two kinds of CAR and non-transfected cord blood NK cells (P＜0.05).In all the samples,NK cells were predominant［(60.12±13.08)%］with some NKT cells［(8.37±1.10)%］,CD4+T lymphocyte［(19.51±7.83)%］and CD8+T lymphocyte［(10.16±4.75)%］.

2.3 HAPD1-CAR19-CBNK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞高效特異殺傷作用

將HAPD1-CAR19 CBNK細(xì)胞與熒光標(biāo)記的靶細(xì)胞Naml6（CD19+）進(jìn)行共培養(yǎng)24 h后，顯示多數(shù)Naml6細(xì)胞（直徑較大）周圍特異結(jié)合有多個免疫細(xì)胞（直徑小），大部分腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜破裂，呈溶解趨勢；表達(dá)綠色熒光的Naml6細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖3A）。

感染兩種轉(zhuǎn)基因的CBNK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效率均優(yōu)于普通CBNK 細(xì)胞（P＜0.05）；而HAPD1-CAR19 CBNK細(xì)胞在低效靶比下（5∶1、10∶1）殺傷效率高于普通CAR-CBNK 細(xì)胞［（68.38±8.08）%，（79.11±7.42）%vs（49.65±13.60）%，（59.78±9.32）%；P＜0.05，圖3B、C］。3種CBNK細(xì)胞在感染后培養(yǎng)9～12 d具有最佳的殺傷活性，且在每個培養(yǎng)時間段HAPD1-CAR19 CBNK細(xì)胞對腫瘤殺傷的效率都最高（圖3D）。

圖3 HAPD1-CAR19 CBNK細(xì)胞對腫瘤靶細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)Fig.3 Lytic efficacy of HAPD1-CAR CBNKs on target tumor cells.A:After co-culture with HAPD1-CAR CBNKs for 24 h,most of the fluorescence-labeled Naml6 cells (larger cells) were surrounded by multiple NK cells (smaller ones),and some of the tumor cells showed a tendency of dissolution.The number of cells expressing green fluorescence in HAPD1-CAR CBNKs was significantly decreased compared with the control (P＜0.05).B:Lytic efficacy of the two CAR transfected and non-transfected cord blood NK cells against target cells at different target ratios.All the 34 immune cells had killing effect on the target cells,but the killing effect of the two CAR-transfected cells was more significant.C:Comparison of lytic efficiency of the two CAR-transfected and non-transfected umbilical cord blood NK cells at different target ratios (n=6,*P＜0.05).D:Lytic efficacy of CAR-transfected and non-transfected cord blood NK cells on target cells at different culture time.*P＜0.05 vs day 7,15.

2.4 HAPD1-CAR19 CBNK細(xì)胞在小鼠體內(nèi)高效抑制淋巴瘤細(xì)胞

Naml6荷瘤小鼠在造模19～21 d時全部出現(xiàn)食欲下降、體質(zhì)量減輕、精神萎靡，隨后弓背抬高，后腳癱瘓等發(fā)病癥狀，發(fā)病后3 d左右即死亡。抑制CBNK細(xì)胞的小鼠在第23～26天開始發(fā)病，發(fā)病后3 d左右死亡；移植兩種轉(zhuǎn)基因CAR-CBNK細(xì)胞的動物在觀察期內(nèi)（3月）無死亡情況。造模后第4天，移植NK細(xì)胞進(jìn)行治療，并于第14、21、28天計數(shù)小鼠血液單個核細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光的腫瘤細(xì)胞比例（圖4A）；與PBS對照相比，移植3種CBNK細(xì)胞的動物血液中腫瘤細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）；而移植兩種轉(zhuǎn)基因CBNK細(xì)胞的小鼠腫瘤細(xì)胞負(fù)荷在第21、28 天少于移植普通CBNKs 組（P＜0.05）；在第28天，HAPD1-CAR19-CBNKs移植組小鼠血液中腫瘤細(xì)胞含量低于傳統(tǒng)CAR19-CBNKs［（19.21±3.07）%vs(29.08±3.15）%，P＜0.05，圖4B］。

圖4 雙效CBNK細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)能更好地抑制Naml6細(xì)胞增殖Fig.4 HAPD1-CAR CBNKs suppress the growth of Naml6 cells in the blood of mice.The mice were inoculated with LucG-naml6 cells(day 0),and 4 days after inoculation,the mice received transplantation of CARs-transfected or untransfected cord blood NK cells or PBS.A:EGFP-expressing naml6 cells in blood mononuclear cells on day 14.B:Quantification of Naml6 cells in blood on days 14,21 and 28.The mice treated with all the CBNKs showed significantly less Naml6 cells in the blood.The two CAR19-NK cells were more effective to suppress growth of Naml6 cells(*P＜0.05).

3 討論

本研究比較了HAPD1-CAR19-CBNK細(xì)胞和常規(guī)CAR19-CBNK 細(xì)胞在腫瘤殺傷效率的差別，普通CAR-CBNK細(xì)胞在識別腫瘤細(xì)胞后，內(nèi)源PD1可能與靶細(xì)胞結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的激活，導(dǎo)致腫瘤殺傷失敗，雙效NK細(xì)胞結(jié)合腫瘤細(xì)胞后，由于表達(dá)高親和PD1突變體（HAPD1），可優(yōu)先于靶細(xì)胞的PD-L1結(jié)合。由于沒有內(nèi)部信號區(qū)，HAPD1將阻斷胞內(nèi)免疫抑制信號，從而實現(xiàn)更有效的腫瘤殺傷。

CAR-CBNK細(xì)胞由于其存活時間短暫無法長期駐留在宿主體內(nèi)發(fā)生作用導(dǎo)致其療效有待進(jìn)一步提高，研究者們嘗試了多種方案來提高其增殖效率和細(xì)胞毒性等［29,30］。本研究將一種具有競爭性結(jié)合PD-L1的高親和PD-1片段但其大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于單克隆抗體且不含有抗體Fc 部分的基因片段［27］整合至CAR，隨后轉(zhuǎn)染CBNK 細(xì)胞構(gòu)建一種能夠競爭性結(jié)合PD-1 的CARCBNK細(xì)胞，研究其可行性并與傳統(tǒng)CAR-CBNK細(xì)胞相比較觀察其是否可進(jìn)一步提高其抗腫瘤效力，結(jié)果表明，所構(gòu)建的HAPD1 CAR載體轉(zhuǎn)導(dǎo)CBNK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性以及免疫表型均與普通CAR-CBNK細(xì)胞沒有顯著差異。體外殺傷活性試驗結(jié)果顯示：表達(dá)HAPD1 CAR的CBNK細(xì)胞在低效靶比下（5∶1、10∶1）顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)CAR-CBNK細(xì)胞的抗腫瘤效力，這可能高親和PD-1競爭性結(jié)合了腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1，使腫瘤細(xì)胞無法通過此機(jī)制抑制免疫細(xì)胞殺傷活性，因此在低效靶比下仍能夠有較高的殺傷效率，提示HAPD1 CAR-CBNK細(xì)胞在將來轉(zhuǎn)化應(yīng)用階段可降低用量，降低生產(chǎn)成本。動物實驗結(jié)果表明，CBNK細(xì)胞及兩種轉(zhuǎn)基因CAR-CBNK對血液中腫瘤細(xì)胞均具有很好的殺傷作用，能有效延長急性淋巴瘤發(fā)病時間，改善動物生存質(zhì)量。其中兩種轉(zhuǎn)基因CARCBNK細(xì)胞作用更明顯。HAPD1 CAR-CBNK細(xì)胞在移植1月后相比傳統(tǒng)CAR19-CBNKs具有更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長的效率。

另外，本研究對CAR-CBNK細(xì)胞的制備方法進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，進(jìn)一步提高了其擴(kuò)增效率和質(zhì)量。文獻(xiàn)報導(dǎo)在無滋養(yǎng)層細(xì)胞條件下很難擴(kuò)增出滿意的細(xì)胞量［31］，不經(jīng)過流式分選直接用臍血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞所獲得的細(xì)胞其中NK細(xì)胞的含量多數(shù)在30%～80%［32］，且NK細(xì)胞由于其會對感染用病毒進(jìn)行攻擊而曾經(jīng)被認(rèn)為難于被慢病毒轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染效率＜10%）［33］。本研究采用無血清培養(yǎng)基從臍血單個核細(xì)胞中直接誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞，通過優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝以及病毒感染程序，成功地將來源于一份臍血的轉(zhuǎn)導(dǎo)與非轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR的免疫細(xì)胞擴(kuò)增至足夠臨床使用量（轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR的細(xì)胞達(dá)2～3×109而不轉(zhuǎn)染CAR的細(xì)胞達(dá)5～10×109），NK細(xì)胞含量（60.12±13.08）%，轉(zhuǎn)染效率20%左右。

本研究通過檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)對其中所含細(xì)胞亞群進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，其中細(xì)胞以NK細(xì)胞為主（60.12±13.08）%，另外還含有部分NKT細(xì)胞（8.37±1.10）%、CD4+T淋巴細(xì)胞（19.51±7.83）%及CD8+T淋巴細(xì)胞（10.16±4.75）%。此結(jié)果可為將來CAR-CBNK細(xì)胞的質(zhì)量鑒定提供參考。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一種表達(dá)高親和PD-1的雙效CAR-CBNK細(xì)胞并優(yōu)化了其制備工藝，其在體外及體內(nèi)均可進(jìn)一步提高CAR免疫治療療效，為腫瘤免疫治療提供了一種更具效力的CAR產(chǎn)品并為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床應(yīng)用方案建立奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：本研究未受企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。