支氣管哮喘患者血清lncRNA PVT1表達(dá)與氣道炎癥、重塑的相關(guān)性

禹陽(yáng)明，王丹，張亞莉

安康市人民醫(yī)院呼吸科，陜西 安康 725000

支氣管哮喘是一種以氣道炎癥和氣道重塑為主要特征的慢性氣道異質(zhì)性疾病，受多種細(xì)胞及因子調(diào)控。近年來(lái)，受環(huán)境、遺傳等因素影響，我國(guó)支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。隨著診治水平和患者對(duì)疾病認(rèn)知程度不斷提高，部分城市支氣管哮喘控制水平有明顯提高，但整體控制水平仍不理想，支氣管哮喘發(fā)病對(duì)居民日常生活造成嚴(yán)重影響[1]。因此尋找支氣管哮喘進(jìn)展中新的生物標(biāo)志物，對(duì)及時(shí)評(píng)估患者病情和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA漿細(xì)胞瘤變異易位基因1（long non-coding RNA plasmacytoma variant translocation，lncRNA PVT1）位于原癌基因MYC下游，被證實(shí)與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[2]。ZHANG等[3]研究報(bào)道，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜組織中l(wèi)ncRNA PVT1高表達(dá)，沉默lncRNA PVT1有抑制細(xì)胞增殖、減輕炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程在支氣管哮喘氣道重塑中發(fā)揮重要作用[4]，SHEN等[5]在胰腺癌中研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1可通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。由于以往對(duì)lncRNA PVT1在支氣管哮喘中表達(dá)水平及意義研究極少，本研究通過(guò)檢測(cè)支氣管哮喘患者血清lncRNA PVT1水平，分析其與患者氣道炎癥和氣道重塑關(guān)系，探究其在支氣管哮喘進(jìn)展中意義，以期為臨床診治提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年5月至2020年5月安康市人民醫(yī)院呼吸科收治的80例支氣管哮喘患者作為研究對(duì)象，根據(jù)支氣管哮喘防治指南[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)，將入組患者分為急性發(fā)作期組43例和慢性持續(xù)期組37例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)；②病程在1年以上；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有其他肺部疾病者；②患有免疫性疾病及心、腎、肝臟等器官功能嚴(yán)重不足者；③合并患有惡性腫瘤者；④孕期及哺乳期患者。另選取同期在本院體檢顯示健康者78例作為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有受試者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（型號(hào)：7500，美國(guó)ABI公司）、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（型號(hào)：LH 755，美國(guó)Beckman Coulter有限公司）、肺功能檢測(cè)儀（型號(hào)：MS-IOS，德國(guó)Jaeger公司）、RNA提取試劑盒（貨號(hào)：R1200-100，北京索萊寶科技有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：K1622，美國(guó)Thermo公司）、人白介素-6（interleukin 6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：70-EK106/2-96，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）、人白介素-17（interleukin 17，IL-17）ELISA試劑盒（貨號(hào)：E01I0309，上海藍(lán)基生物科技有限公司）、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA試劑盒（貨號(hào)：FY-04048H2，上海富雨生物科技有限公司）、人免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）ELISA試劑盒（貨號(hào)：GN-H11258，上海蓋寧生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與一般資料收集所有入組支氣管哮喘患者和健康者分別于入組時(shí)和體檢時(shí)清晨（7:00～9:00）空腹?fàn)顟B(tài)采集外周靜脈血5 mL，3 000 r/min條件下離心20 min后取上清液，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ占虢M支氣管哮喘患者和健康者性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙情況及支氣管哮喘患者哮喘控制測(cè)試（asthma control test，ACT）評(píng)分。

1.3.2 血清lncRNA PVT1表達(dá)水平檢測(cè)采用qRT-PCR法檢測(cè)所有入組者血清lncRNA PVT1表達(dá)水平。使用RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA后，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)體系（20μL）如下：10μL Mix，0.4μL ROX，2μL cDNA，0.8μL上游引物、0.8μL下游引物，6.0μL無(wú)酶水。具體反應(yīng)步驟如下：95℃、35 s，1個(gè)循環(huán)；95℃、5 s，63℃、37 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，用2-△△CT法計(jì)算lncRNA PVT1表達(dá)水平。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)所用引物如表1所示。

1.3.3 血清其他指標(biāo)測(cè)定使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行外周血嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil count，EOS）計(jì)數(shù)，使用ELISA法 進(jìn) 行血清IL-6、IL-17、TGF-β、IgE水平測(cè)定，嚴(yán)格按照儀器和試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.4 氣道重塑及肺功能指標(biāo)測(cè)定經(jīng)高分辨率胸部CT檢查，在CT圖片上使用電子標(biāo)尺測(cè)量氣道外直徑（D）、內(nèi)直徑（L），每張CT連續(xù)測(cè)量三次，取平均值。計(jì)算支氣管厚度（T/D）=（D-L）/D；管壁面積占支氣道總橫截面積百分比（WA%）=（D2-L2）/D2×100%。使用肺功能檢測(cè)儀進(jìn)行肺功能指標(biāo)第一秒用力呼氣量（forced expired volume，F(xiàn)EV1）、一秒率預(yù)計(jì)值（forced expired volume percentage，F(xiàn)EV1%）、最高呼吸氣流（peak expiratory flow，PEF）水平測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS22.0軟件對(duì)本文中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組間比較行單因素方差分析，總體有差異時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較行檢驗(yàn)；采用Pearson法分析支氣管哮喘患者血清lncRNA PVT1水平與氣道炎癥、重塑指標(biāo)相關(guān)性。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者的一般資料比較三組受檢者的性別、年齡、BMI、吸煙比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。急性發(fā)作期組患者的ACT評(píng)分明顯低于慢性持續(xù)期組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組受檢者的一般資料比較[例（%），±s]

表1 三組受檢者的一般資料比較[例（%），±s]

組別急性發(fā)作期慢性持續(xù)期對(duì)照組χ2/F/t值P值例數(shù)43 37 78男/女（例）23/20 19/18 41/37 0.036 0.982年齡（歲）38.36±12.29 38.94±12.73 38.51±12.16 0.024 0.976 BMI（kg/m2）23.91±5.87 24.12±6.09 24.65±6.74 0.212 0.809吸煙11（25.58）9（24.32）12（15.00）2.280 0.320 ACT評(píng)分17.82±1.96 23.04±1.85-12.188 0.001

2.2 三組受檢者的血清lncRNA PVT1表達(dá)水平比較急性發(fā)作期組患者血清lncRNA PVT1表達(dá)水平明顯高于慢性持續(xù)期組和對(duì)照組，而慢性持續(xù)期組患者的血清lncRNA PVT1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組受檢者的血清lncRNA PVT1表達(dá)水平比較（±s）

表2 三組受檢者的血清lncRNA PVT1表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與慢性持續(xù)期組比較，bP＜0.05。

組別急性發(fā)作期慢性持續(xù)期對(duì)照組F值P值例數(shù)43 37 78 lncRNA PVT1 4.63±1.52ab 2.37±0.75a 1.02±0.34 221.937 0.001

2.3 三組受檢者的氣道炎癥相關(guān)指標(biāo)比較急性發(fā)作期組患者的血清IL-6、IL-17、TGF-β、IgE及血EOS水平明顯高于慢性持續(xù)期組和對(duì)照組，而慢性持續(xù)期組患者的上述各項(xiàng)指標(biāo)明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組受檢者的氣道炎癥相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表3 三組受檢者的氣道炎癥相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與慢性持續(xù)期組比較，bP＜0.05。

組別急性發(fā)作期慢性持續(xù)期對(duì)照組F值P值例數(shù)43 37 78 IL-6（pg/mL）86.54±22.03ab 69.82±20.36a 53.19±16.05 44.239 0.001 IL-17（ng/L）43.25±13.19ab 23.07±7.29a 17.57±5.65 123.781 0.001 TGF-β（ng/L）347.19±108.01ab 169.58±51.33a 73.62±21.07 259.732 0.001 IgE（kU/L）516.58±147.05ab 273.04±88.21a 57.39±18.52 377.872 0.001 EOS（×109/L）0.67±0.21ab 0.25±0.07a 0.13±0.04 296.391 0.001

2.4 三組受檢者的氣道重塑及肺功能指標(biāo)比較與對(duì)照組比較，慢性持續(xù)期組患者氣道重塑指標(biāo)T/D、WA%水平明顯升高，肺功能指標(biāo)FEV1、FEV1%、PEF水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組和慢性持續(xù)期組比較，急性發(fā)作期組患者氣道重塑指標(biāo)T/D、WA%水平明顯升高，肺功能指標(biāo)FEV1、FEV1%、PEF水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 三組受檢者的氣道重塑及肺功能指標(biāo)比較（±s）

表4 三組受檢者的氣道重塑及肺功能指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與慢性持續(xù)期組比較，bP＜0.05。

組別急性發(fā)作期慢性持續(xù)期對(duì)照組F值P值例數(shù)43 37 78 T/D 0.45±0.14ab 0.37±0.11a 0.21±0.06 88.538 0.001 WA%67.58±5.73ab 59.64±5.82a 43.61±4.97 301.798 0.001 FEV1（L）1.73±0.45ab 2.56±0.61a 3.04±0.85 47.554 0.001 FEV1%68.22±7.41ab 80.37±9.39a 92.64±12.05 78.591 0.001 PEF（L/s）ab3.72±1.19 a5.34±1.65 7.92±2.26 73.518 0.001氣道重塑 肺功能

2.5 支氣管哮喘患者血清lncRNA PVT1水平與氣道炎癥、重塑指標(biāo)的相關(guān)性急性發(fā)作期組和慢性持續(xù)期組患者血清lncRNA PVT1水平均與IL-6、TGF-β、T/D、WA%水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與FEV1、FEV1%水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表5。

表5 支氣管哮喘患者血清lncRNA PVT1水平與氣道炎癥、重塑指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

支氣管哮喘患者早期出現(xiàn)短暫性呼吸困難、胸悶、咳嗽、呼吸時(shí)反復(fù)喘息等癥狀。若早期癥狀不能得到有效緩解，支氣管哮喘易進(jìn)展至急性發(fā)作期，多數(shù)患者表現(xiàn)為喘息、氣促、胸悶、咳嗽等突然發(fā)生并持續(xù)加重，目前只能通過(guò)藥物緩解病情進(jìn)展或自行緩解，而不能完全治愈[7]。有研究表明，ACT評(píng)分可反映支氣管哮喘患者病情控制水平[8]。本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作期組患者ACT評(píng)分明顯低于慢性持續(xù)期組患者，與王鴻雁等[8]研究結(jié)果一致。

lncRNA是一種長(zhǎng)度大于200 nt的具有疾病調(diào)控功能的非編碼RNA。有研究表明，lncRNA生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄本5水平異?？捎绊憵獾榔交〖?xì)胞和氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)支氣管哮喘等慢性氣道疾病發(fā)病和持續(xù)進(jìn)展[9]。ZHANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA腦細(xì)胞質(zhì)RNA1在模型哮喘大鼠中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)增大氣道平滑肌活性發(fā)揮其致病作用。提示lncRNA可能參與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展。有研究報(bào)道，支氣管哮喘患者氣道平滑肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)水平上調(diào)，與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、慢性持續(xù)期組、急性發(fā)作期組血清lncRNA PVT1表達(dá)水平依次顯著升高，與AUSTIN等[11]研究結(jié)果相似，提示血清lncRNA PVT1表達(dá)水平升高可能預(yù)示支氣管哮喘發(fā)生、發(fā)展。

有研究表明支氣管哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-17、TGF-β、IgE、EOS水平顯著高于對(duì)照組，下調(diào)其表達(dá)可緩解模型小鼠氣道炎癥[12-13]。本研究結(jié)果顯示，血清IL-6、IL-17、TGF-β、IgE及血EOS水平在對(duì)照組、慢性持續(xù)期組和急性發(fā)作期組依次顯著升高，與前人研究結(jié)果基本一致，提示支氣管哮喘患者氣道炎癥水平隨病情加重而升高[12-13]。常琴等[14]研究發(fā)現(xiàn)，氣道重塑可導(dǎo)致支氣管哮喘患者不可逆性氣流受限。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、慢性持續(xù)期組和急性發(fā)作期組氣道重塑指標(biāo)T/D、WA%水平依次顯著升高，肺功能指標(biāo)FEV1、FEV1%、PEF水平依次顯著降低，提示支氣管哮喘患者存在不同程度的氣道重塑和肺功能損傷。

HUANG等[15]在感染性急性腎損傷研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1可通過(guò)誘導(dǎo)IL-6等炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。WANG等[16]研究報(bào)道，沉默宮頸鱗癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PVT1可抑制癌細(xì)胞增殖，減少TGF-β表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性發(fā)作期組和慢性持續(xù)期組患者血清lncRNA PVT1水平均與IL-6、TGF-β水平呈正相關(guān)，提示血清中l(wèi)ncRNA PVT1與IL-6、TGF-β可能存在一定相互作用，共同參與支氣管哮喘患者氣道炎癥進(jìn)展。HUR等[17]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)哮喘模型小鼠肺成纖維細(xì)胞TGF-β表達(dá)時(shí)，氣道高反應(yīng)和氣道重塑杯狀細(xì)胞增生受到抑制，哮喘癥狀減輕。有研究報(bào)道，慢性阻塞性肺疾病患者血清TGF-β水平越高，F(xiàn)EV1越低，TGF-β可在一定程度上反映患者肺功能水平[18]。本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作期組和慢性持續(xù)期組患者血清lncRNA PVT1水平均與氣道重塑指標(biāo)T/D、WA%水平呈正相關(guān)，與肺功能指標(biāo)FEV1、FEV1%水平呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA PVT1可能通過(guò)上調(diào)TGF-β表達(dá)，促進(jìn)支氣管哮喘患者氣道重塑和誘導(dǎo)肺功能損傷。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程與支氣管患者氣道重塑密切相關(guān)[3]。ZHANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1通過(guò)上調(diào)E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白等上皮標(biāo)記蛋白及TGF-β表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。提示，lncRNA PVT1可能通過(guò)調(diào)控TGF-β水平，促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，與對(duì)照組相比，慢性持續(xù)期組、急性發(fā)作期組患者血清lncRNA PVT1表達(dá)水平顯著升高，與IL-6、TGF-β等氣道炎癥指標(biāo)和T/D、WA%等氣道重塑指標(biāo)呈正相關(guān)，與FEV1、FEV1%等肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。血清lncRNA PVT1可能作為生物標(biāo)志物，預(yù)示支氣管哮喘患者氣道炎癥和氣道重塑水平，可能對(duì)臨床評(píng)估患者病情和確定治療方案有一定幫助。但由于本研究樣本量較少，相關(guān)機(jī)制探尋尚需進(jìn)一步納入更多樣本量、進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)研究。