人羊膜提取物對小鼠胰島缺氧損傷的保護作用及其分子機制

郭庭維，楊召銘，李峰，林建貞，張城碩，孫寧，李曉航，張佳林

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，沈陽 110001）

自Edmonton方案問世以來，胰島移植在過去的幾十年間取得了顯著進展，目前被認為是治療1型糖尿病最有前景的方法之一［1］。胰島移植可以恢復糖尿病患者胰島素的生理性分泌，最大限度降低因嚴重低血糖導致的死亡風險。目前臨床胰島移植尚存在許多不足，主要包括供胰短缺、需要終身使用免疫抑制藥物及胰島移植物體內長期存活率低等。其中，缺氧是導致移植前培養(yǎng)胰島及移植后胰島移植物活性及功能喪失的關鍵因素之一［2-6］。因此，避免胰島受到缺氧損傷具有重要的臨床意義。

人羊膜提取物（human amniotic membrane extract，hAME）是一種天然的生物材料，含有豐富的生物活性分子，目前已被臨床應用于眼部疾病的治療。研究［7-10］表明，hAME能促進組織再生和傷口愈合，具有減輕炎癥反應和減少氧化應激損傷的功能。

本研究通過建立小鼠腎被膜下胰島移植模型，擬探討hAME對小鼠胰島缺氧損傷的保護作用及相關分子機制，進一步通過體內移植研究驗證在缺氧狀態(tài)下經hAME預處理的胰島治療糖尿病的效果。

1 材料與方法

1.1 動物

C57BL/6小鼠由遼寧長生生物科技有限公司提供。選擇6～8周齡、體質量18～22 g的雄性C57BL/6小鼠作為胰島供體和糖尿病受體。所有手術均采用異氟醚吸入麻醉（RWD，中國瑞沃德公司）。本研究按照國家衛(wèi)生研究院實驗動物指導與使用指南進行，并經中國醫(yī)科大學動物福利倫理委員會批準。

1.2 hAME的制備

本研究通過中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學科學研究倫理委員會批準（［2019］2019-219-3），選取在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產科進行剖宮產手術的健康產婦，經受試者同意且簽署知情同意書后，收集剖宮產孕婦羊膜。將人羊膜用含1 000 U/mL青霉素和 0.1 mg/mL鏈霉素雙抗的PBS清洗3次，洗去殘余的血塊。羊膜切成碎塊后置于液氮中研磨成細粉。稱重后按質量體積比1 ∶1加入PBS混合，在冰上用超聲勻漿機以10 000 r/min的參數超聲勻漿1 h。然后在4 ℃離心機中以4 000g的離心力離心10 min，收集上清，以15 000g的離心力離心5 min。收集最終上清液并通過0.22 μm濾器濾菌，即得hAME，所得hAME置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小鼠胰島的分離和缺氧培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死小鼠，充分暴露腹腔，用6-0絲線結扎膽總管匯入十二指腸處后，用膠原酶V（1 mg/mL）2～3 mL充分灌注小鼠胰腺，在37 ℃恒溫水浴鍋中靜置消化20 min。然后，用含10% FBS的預冷Hanks平衡鹽溶液終止消化。使用Ficoll密度梯度離心法純化小鼠胰島（密度1.108、1.096、1.069和1.037 g/mL），并通過體視顯微鏡手動挑選，進一步純化小鼠胰島。將純化后的小鼠胰島隨機分為4組：1%O2缺氧培養(yǎng)組、缺氧培養(yǎng)加hAME實驗組、正常氧氣培養(yǎng)組、正常氧氣培養(yǎng)加hAME組。各組胰島置于37 ℃濕潤的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。胰島基礎培養(yǎng)基為含10%FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640。

1.4 胰島活性檢測

缺氧培養(yǎng)12 h后，用吖啶橙（acridine orange，AO，美國Sigma公司）和溴化乙錠（ethidium bromide，EB，美國Sigma公司）染色評估胰島的活性，其中活細胞在熒光顯微鏡下呈綠色。采集熒光圖像并使用Image J軟件分析胰島細胞的活性。小鼠胰島的活性通過以下公式計算：胰島活性（%）=綠色熒光所占面積/（綠色熒光所占面積+紅色熒光所占面積）×100。

1.5 葡萄糖刺激胰島素分泌試驗

缺氧培養(yǎng)12 h后，收集胰島進行葡萄糖刺激胰島素釋放試驗。每組隨機選取10個胰島置于含2.8 mmol/L葡萄糖的克-林二氏重碳酸鹽緩沖液（Krebs-Ringerbicarbonate buffer，KRBH）中預孵育30 min。預孵育后，將胰島分別在含糖2.8 mmol/L（低）和16.8 mmol/L（高）葡萄糖的KRBH中孵育1 h。收集上清液，采用小鼠超敏胰島素酶聯免疫吸附檢測試劑盒（10-1249-01，瑞典Mercodia公司）測定各個樣品中胰島素濃度。刺激指數（stimulation index，SI）按以下公式計算：SI=高糖刺激下胰島分泌的胰島素/低糖環(huán)境下胰島分泌的胰島素。

1.6 胰島細胞核因子相關因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白表達檢測

Western blotting檢測胰島細胞內Nrf2和HO-1蛋白表達的水平。探討加入hAME培養(yǎng)的胰島細胞，相較于不加入hAME培養(yǎng)的胰島細胞，在缺氧和正常培養(yǎng)環(huán)境下抵抗氧化應激的能力是否增強。

1.7 小鼠腎被膜下胰島移植

1.7.1 糖尿病小鼠模型的誘導及分組進行移植：采用鏈脲佐菌素（S0130，美國Sigma公司）誘導小鼠糖尿病模型。將糖尿病小鼠隨機分為4組，分別為缺氧培養(yǎng)對照組（n=10）、缺氧培養(yǎng)+hAME實驗組（n=10）、假手術組（Sham組，n=6）、正常對照組（Naive組，n=6）。在體外培養(yǎng)12 h后，隨機挑選200個胰島移植到受體小鼠腎被膜下。假手術組和正常對照組用于與實驗組和對照組進行比較。移植術后每3 d相同時間段測量并記錄小鼠的非禁食血糖值。連續(xù)2次測量血糖值＜11.1 mmol/L視為糖尿病小鼠血糖恢復至正常。在觀察6周后，將受體小鼠含胰島移植物的左腎切除后，監(jiān)測非禁食血糖7 d。

1.7.2 腹腔葡萄糖耐量測試（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）：用IPGTT評估移植后小鼠體內胰島移植物的功能，在移植術后第30天，將胰島移植后糖尿病逆轉的小鼠禁食不禁水過夜，然后腹腔注射葡萄糖（2 g/kg）。在注射后0、15、30、60、90、120 min測量血糖，繪制血糖變化趨勢曲線并計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.7.3 移植物組織病理學觀察：在移植術后第42天，切取胰島移植物，并進行固定、石蠟包埋、切片及蘇木素-伊紅（hematoxylin/eosin，HE）染色、胰島素免疫組化染色及胰島素和胰高血糖素熒光雙標染色，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用Graph-Pad Prism 6軟件（GraphPad Software，lnc.，USA）進行數據統(tǒng)計分析及作圖，所有數據以表 示。采 用One-way ANOVA、t檢驗及Tukey’s multiple comparisons test進行統(tǒng)計學分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hAME對缺氧培養(yǎng)胰島活性的影響

經過12 h的體外培養(yǎng)，缺氧組相較于正常氧氣培養(yǎng)組胰島活性明顯降低（P＜ 0.000 1）。與缺氧組相比，加入不同濃度（0.25～1.0 mg/mL）hAME的胰島活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），且在hAME濃度為0.75 mg/mL時對缺氧胰島的保護作用達到峰值，見圖1。

圖1 hAME提高缺氧培養(yǎng)胰島的活性Fig.1 hAME improves the activity of hypoxic cultured islets

2.2 hAME對缺氧培養(yǎng)胰島的胰島素分泌功能的影響

如圖2所示，在低糖（2.8 mmol/L）刺激下各組胰島之間的胰島素分泌量無明顯差異；在高糖（16.8 mmol/L）刺激下，缺氧對照組與hAME濃度為0.25 mg/mL時胰島的胰島素分泌量相比無明顯差異（P＞0.05）。但添加濃度為0.5、0.75及1.0 mg/mL hAME時，缺氧胰島的胰島素分泌量均明顯增多，且在hAME濃度為0.75 mg/mL時達到峰值。綜上所述，hAME在濃度為0.75 mg/mL時對缺氧胰島的保護作用最明顯，故選擇濃度為0.75 mg/mL的hAME用于后續(xù)研究。

圖2 葡萄糖刺激下的胰島素分泌實驗和刺激指數分析Fig.2 Insulin secretion experiment and stimulation index analysis under glucose stimulation

2.3 hAME對缺氧狀態(tài)下的胰島Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

如圖3所示，缺氧培養(yǎng)組與正常氧氣培養(yǎng)組相比，胰島蛋白中Nrf2和HO-1的表達明顯增加（P＜0.000 1）。與缺氧培養(yǎng)組相比，正常氧氣培養(yǎng)+hAME組胰島蛋白中Nrf2（P＜ 0.001）和HO-1（P＜ 0.000 1）的表達增加，差異有統(tǒng)計學意義。此外，正常氧氣培養(yǎng)+hAME組相比正常氧氣培養(yǎng)組，Nrf2（P＜ 0.001）和HO-1（P＜ 0.000 1）的表達增加，差異有統(tǒng)計學意義。

圖3 Western blotting檢測胰島Nrf2和HO-1蛋白表達的變化Fig.3 Western blotting to detect Nrf2 and HO-1 protein expression changes in the pancreatic islets

2.4 缺氧培養(yǎng)后胰島移植治療小鼠糖尿病的效果

2.4.1 糖尿病受體小鼠非禁食血糖及體質量監(jiān)測：為了進一步確定缺氧培養(yǎng)后胰島移植治療小鼠糖尿病的效果，在缺氧培養(yǎng)12 h后，將等量的胰島移植到糖尿病受體小鼠腎被膜下。如圖4所示，與缺氧培養(yǎng)組相比，缺氧培養(yǎng)+hAME組的血糖AUC顯著降低 ［（936.6±43.94）vs（673.4±29.53）mmol/L，P＜0.000 1］；圖4C顯示在42 d的血糖檢測期間，缺氧培養(yǎng)組和缺氧培養(yǎng)+hAME組中個體的非禁食血糖變化；圖4D小鼠體質量監(jiān)測表明，與缺氧培養(yǎng)組相比，缺氧培養(yǎng)+hAME組的小鼠體質量明顯增高 ［AUC（383.1±10.47）vs（298.8±10.94）g/42 d，P＜ 0.000 1］。

圖4 胰島移植后糖尿病受體小鼠血糖及體質量監(jiān)測Fig.4 Blood glucose and body weight monitoring of diabetic recipient mice after islet transplantation

2.4.2 IPGTT：缺氧培養(yǎng)+hAME組的腹腔葡萄糖耐量試驗的AUC明顯低于缺氧培養(yǎng)組 ［（1 553±90.96）vs（1 836±48.78）mmol/L（120 min），P＜ 0.001］，表明缺氧培養(yǎng)+hAME組的胰島移植物比缺氧培養(yǎng)組有更好的血糖調節(jié)能力。見圖5。

圖5 腹腔葡萄糖耐量試驗Fig.5 Intraperitoneal glucose tolerance test

2.4.3 胰島移植物的組織病理學染色：將受體小鼠的胰島移植物所在腎臟取出并進行組織學染色。圖6為胰島移植物的HE染色、胰島素的免疫組織化學染色以及胰島素和胰高血糖素的免疫熒光雙標染色的圖像。結果顯示，Hypoxia+hAME組相較于Hypoxia組胰島移植物面積更大。

圖6 胰島移植物組織學染色Fig.6 Histological islet graft staining

3 討論

胰島對缺氧十分敏感，在移植前胰腺保存、消化以及胰島純化過程中，胰島的活性和分泌功能受到缺氧影響，最終導致移植效果不理想。為減少缺氧造成胰島活性和功能的損傷，科學家進行了許多研究，例如在缺氧培養(yǎng)中充入適量的CO［11］、降低培養(yǎng)時的溫度［12］、使用膠原蛋白構建的生物支架等以改善缺氧環(huán)境中胰島的活性和功能［13］。羊膜作為一種天然的生物材料，含有豐富的生物活性分子且免疫原性低，目前被應用于臨床燒傷和眼科疾病的治療［14-16］。研究［17］表明，hAME在胰島培養(yǎng)中作為培養(yǎng)基添加劑改善胰島活性及分泌功能。以上結果提示hAME具有細胞保護作用，并可能在胰島移植缺氧環(huán)境中充當保護劑。此外，在胰島受到氧化應激損傷時，Nrf2作為抗氧化應激的轉錄因子［18］，可通過誘導HO-1表達來應對氧化應激和炎癥［19］。有研究［10］表明hAME通過調節(jié)Nrf2/HO-1通路來保護H9c2細胞免受低氧導致的氧化應激，因此，筆者推斷hAME對缺氧狀態(tài)下胰島的保護作用可能涉及Nrf2/HO-1通路。在本研究中，添加hAME可以在缺氧狀態(tài)下明顯改善胰島活力和胰島素分泌功能，同時增加了缺氧狀態(tài)胰島細胞內Nrf2和HO-1的表達，這與之前的推斷一致。在42 d的移植觀察期內，與對照組相比，加入hAME的實驗組胰島移植效果有顯著改善，這表明在缺氧環(huán)境下加入hAME培養(yǎng)的胰島具有更高的活性和調節(jié)血糖的能力。本研究對hAME于缺氧狀態(tài)下胰島的活性及分泌功能的保護作用進行了初步研究，不良反應和hAME的具體成分有待進一步探討。

綜上所述，本研究證明hAME可改善缺氧狀態(tài)下胰島的活性及葡萄糖刺激胰島素分泌功能，提高缺氧培養(yǎng)胰島細胞內Nrf2/HO-1蛋白的表達，同時改善胰島移植物的功能。hAME是一種天然的生物材料，富含生物活性分子及細胞外基質成分，且易獲取，有望作為胰島缺氧保護劑應用于胰島移植中。