環(huán)指蛋白187過表達(dá)后對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的影響

董俊強(qiáng)，裴美娟，黃生炫，李學(xué)文，滕 川

腦膠質(zhì)瘤是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)起源的最常見的惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40%～50%，因其進(jìn)展快、預(yù)后差，手術(shù)切除、放療及化療效果均欠佳，一直是困擾人類健康的難題[1,2]。膠質(zhì)瘤高侵襲性的特點(diǎn)，是導(dǎo)致傳統(tǒng)治療方案失敗的主要原因[3]，因此，探究膠質(zhì)瘤侵襲潛在的機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。隨著近些年對(duì)腦膠質(zhì)瘤的深入研究，越來越多的腦膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)[4]。最近環(huán)指蛋白187(ring finger protein 187，RNF187)進(jìn)入研究人員的視野并證實(shí)，RNF187是一個(gè)含RING域的E3泛素連接酶，在肝細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)，并通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展[5,6]。然而，RNF187在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中所起的作用，至今仍然沒有研究清楚。本研究試圖探究RNF187對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性度的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87購自上海中科院細(xì)胞庫。RNF187過表達(dá)腺病毒表達(dá)載體AAVrh.10 RNF187與腺病毒衣殼AAVrh.10 Negative購自云舟生物科技(廣州)有限公司。 蛋白抗體RNF187、NLRP3、ASC、GSDMD及GSDME購自美國abcam公司，CCK-8、Trizol及去RNA酶處理的物品購自美國Sigma公司。RT-PCR引物由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。Tranwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)板及計(jì)數(shù)板購自美國康寧公司。 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 U87細(xì)胞在37 ℃和含5% CO2的條件下用含10%胎牛血清、1% 100U/L青/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3組：對(duì)照組、陰性對(duì)照組和RNF187過表達(dá)組。陰性對(duì)照組和RNF187過表達(dá)組U87細(xì)胞分別加入等滴度純化的腺病毒表達(dá)載體AAVrh.10 Negative、AAVrh.10 RNF187，對(duì)照組加入等體積PBS，共培養(yǎng)12 h。根據(jù)細(xì)胞的密度進(jìn)行換液或者傳代。每次傳代時(shí)，加入2.5 μg/ml嘌呤霉素繼續(xù)篩選穩(wěn)定的細(xì)胞株，每隔1 d于熒光顯微鏡觀察細(xì)胞GFP熒光強(qiáng)度，直至熒光強(qiáng)度無明顯變化，無死亡漂浮的細(xì)胞。

1.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈，利用Real-timePCR試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)各蛋白mNRA的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.4 CCK-8(Cell Counting Kit-8)增殖試驗(yàn) 取細(xì)胞懸液約100 μl在具有完全培養(yǎng)液的96 孔板中培養(yǎng)至約5×103/孔(37 ℃、5% CO2)。用10 μl 的CCK-8處理后，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm 處的吸光值。

1.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 梯度倍數(shù)稀釋對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞懸液，分別接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2～3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。棄上清，4%多聚甲醛固定，吉薩姆染色液染10～30 min。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 利用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸各組細(xì)胞至1×104/ml，取200 μl加入Transwell小室中，并將盛有細(xì)胞懸液的Transwell小室置于含有培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)孔中培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，PBS清洗后，利用棉簽擦去小室薄膜上層細(xì)胞后，結(jié)晶紫染色薄膜下層細(xì)胞后，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)拍照。

1.7 Westernblot檢測 取轉(zhuǎn)染后72 h的各組細(xì)胞，破碎后提取蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量每個(gè)樣品的總蛋白質(zhì)量。各組提取等量蛋白50 μg，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜。10%脫脂奶粉4 ℃封閉1 h，然后在含一抗的10%脫脂奶粉的TBST緩沖液過夜：兔單抗NLRP3抗體(1∶1000)、兔單抗ASC抗體(1∶1000)、兔單抗GSDMD抗體(1∶1000)、兔單抗GSDME抗體(1∶1000)、兔單抗RNF187抗體(1∶1000)、兔單抗GAPDH抗體(1∶1000)。TBST沖洗4次，然后將膜與辣根過氧化物酶山羊抗兔(1∶10 000)二抗孵育2 h，TBST沖洗4次，ECL plus用于信號(hào)檢測，Image J軟件用于定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞過表達(dá)RNF187 與對(duì)照組[(1.03±0.12)，(0.35±0.11)]和陰性對(duì)照組[(1.08±0.15)，(0.40±0.08)]相比，RNF187組的RNF187 mRNA及蛋白表達(dá)水平[(2.33±0.41)，(0.78±0.06)]明顯升高(P<0.05)，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。光鏡下可見RNF187組膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫脹膨大，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞之間連接疏松，并有許多氣泡狀突出物(圖2)。

圖1 腦膠質(zhì)瘤RNF187蛋白表達(dá)水平

圖2 腦膠質(zhì)瘤RNF187對(duì)U87細(xì)胞的影響(×200)A.對(duì)照組；B. Negative組；C. RNF187過表達(dá)組

2.2 RNF187過表達(dá)促進(jìn)U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖率[(1.45±0.11)vs.(1.43±0.13)]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RNF187過表達(dá)組細(xì)胞增殖率(2.24±0.16)高于其他兩組(P<0.05)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞克隆數(shù)[(119.3±22.4)vs.(121.5±18.7)]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RNF187過表達(dá)組細(xì)胞的克隆數(shù)(313.4±22.9)高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比穿膜細(xì)胞數(shù)[(84.3±11.5)vs.(79.5±10.2)]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而RNF187組的U87穿膜細(xì)胞數(shù)(226.4±12.6)較其他兩組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 腦膠質(zhì)瘤RNF187過表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞transwell實(shí)驗(yàn)的影響(×200)A.對(duì)照組；B. 陰性對(duì)照組；C. RNF187過表達(dá)組

2.3 RNF187過表達(dá)促進(jìn)U87細(xì)胞發(fā)生焦亡 RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比焦亡相關(guān)mRNA及蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD和GSDME)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，RNF187組焦亡相關(guān)mRNA及蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD和GSDME)表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05，圖4、表2、表3)。

圖4 腦膠質(zhì)瘤RNF187過表達(dá)對(duì)焦亡蛋白的影響

表2 腦膠質(zhì)瘤焦亡蛋白相對(duì)表達(dá)量

表3 腦膠質(zhì)瘤焦亡蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

膠質(zhì)瘤是最危及生命的原發(fā)性腦腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及抑癌基因和致癌基因間平衡的多步驟過程，受到多基因的調(diào)控[7]，膠質(zhì)瘤導(dǎo)致患者死亡的主要原因是其侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，與正常的腦膠質(zhì)細(xì)胞組織相比，RNF187在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87、A172、LN229和SHG-44中過表達(dá)，其中在U87細(xì)胞株表達(dá)水平最高。通過cDNA轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞，本研究提出過表達(dá)RNF187的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體外具有高度侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能?，F(xiàn)在，公認(rèn)的是泛素化在翻譯后蛋白質(zhì)修飾中起著重要作用，調(diào)節(jié)著細(xì)胞許多的關(guān)鍵過程，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)[9]。因此，泛素化參與翻譯后修飾，并在真核生物的不同生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用，泛素功能障礙與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[9]，包括肺癌[10]、大腸癌[11]、肝細(xì)胞癌[12]和膠質(zhì)瘤。上述數(shù)據(jù)表明異常的RNF187可能是腫瘤發(fā)展的重要助推器。

本研究發(fā)現(xiàn)，RNF187過表達(dá)顯著提高焦亡相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD、GSDME)的表達(dá)水平，證明RNF187過表達(dá)能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡的發(fā)生。細(xì)胞焦亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，是一種由gasdermin 蛋白家族介導(dǎo)的程序性死亡[13]。最近有研究表明，細(xì)胞焦亡促進(jìn)早期腫瘤的發(fā)生[14]。此外，RNF187基因敲除被揭示通過抑制激活蛋白-1(AP-1)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來抑制細(xì)胞增殖，RNF187的過表達(dá)激活連環(huán)蛋白(Wnt)和Ras通路，從而加速結(jié)腸上皮中腫瘤的形成[15]。有研究表明，泛素E3連接酶調(diào)控NLRP3表達(dá)，NLRP3的組裝導(dǎo)致caspase-1的激活，觸發(fā)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的釋放，激活細(xì)胞焦亡過程[16]。Wnt可以通過增加NLRP3和ASC之間的聯(lián)系來促進(jìn)NLRP3炎性小體激活[17]，并且多項(xiàng)研究表明NLRP3具有調(diào)控EMT的作用[18]。細(xì)胞焦亡還可促使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，活化的NLRP3炎性小體可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖[19]。凋亡的典型特征之一是由GSDMD引起的質(zhì)膜孔的形成[20]。以上研究表明RNF187過表達(dá)可以激活細(xì)胞焦亡途徑，這可能是促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的關(guān)鍵。

總之，RNF187可通過細(xì)胞焦亡相關(guān)分子通路作用于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞促進(jìn)其惡性演進(jìn)。