基于HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)鑒定熱毒寧注射液中活性成分

徐玉琴 劉娟 歐陽婷 卿志星 劉紅宇

〔摘要〕 目的 利用高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)快速鑒定熱毒寧注射液中主要活性成分，闡明熱毒寧注射液的物質(zhì)基礎(chǔ)及微量成分。方法 采用HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)首先研究綠原酸類、多酚類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，同時結(jié)合文獻，利用已知的質(zhì)譜裂解規(guī)律推測熱毒寧注射液中主要活性成分的結(jié)構(gòu)。結(jié)果 共鑒定熱毒寧注射液中40個化合物，包括14個綠原酸類化合物、13個環(huán)烯醚萜類化合物、13個有機酸類化合物，其中24個化合物首次在熱毒寧注射液中報道。結(jié)論 熱毒寧注射液中主要活性成分為綠原酸、環(huán)烯醚萜和有機酸類化合物。

〔關(guān)鍵詞〕 熱毒寧注射液;高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜;活性成分;質(zhì)譜裂解規(guī)律;結(jié)構(gòu)解析

〔中圖分類號〕R284.1 ? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.010

Identification of Active Components in Reduning Injection Based on HPLC-Q-TOF-MS Technology

XU Yuqin1， LIU Juan1， OUYANG Ting1， QING Zhixing2， LIU Hongyu1*

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China）

〔Abstract〕 Objective To identify the main active ingredients quickly in Reduning injection by high performance liquid chromatography quadrupole time of flight tandem mass spectrometry （HPLC-Q-TOF-MS） technology， and to clarify the material basis and trace components of Reduning injection. Methods The HPLC-Q-TOF-MS technique was first employed to investigation the fragmentation pathways of chlorogenic acids and polyphenols. And then， the structures of the main active ingredients in Reduning injection were speculated using the well-investigated fragmentation pathways of standards combined with the literatures. Results A total of 40 compounds， which including 14 chlorogenic acid， 13 iridoid， and 13 organic acid type compounds were identified from Reduning injection. Among them， 24 compounds were reported for the first time in Reduning injection. Conclusion The chlorogenic acids， iridoids and organic acid compounds were the main active ingredients of Reduning injection.

〔Keywords〕 Reduning injection; HPLC-Q-TOF-MS; active components; fragmentation pathways; structural identification

熱毒寧注射液是由青蒿、金銀花、梔子三味中藥材組方制成的復(fù)方制劑，1 mL熱毒寧注射液由1.25 g青蒿、0.75 g金銀花和0.6 g梔子提取加工而成[1-2]。熱毒寧注射液具有清熱、疏風(fēng)、解毒之功效，臨床上主要用于外感風(fēng)熱所引起的高熱畏寒、頭身疼痛、咳嗽咳痰等上呼吸道感染[3-4]。熱毒寧注射液的主要活性成分為有機酚酸類和環(huán)烯醚萜類，包括綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、梔子苷、京尼平苷酸、京尼平龍膽雙糖苷等[5-6]，除了這些主要的活性成分，熱毒寧注射液中還存在一系列含量較低的化學(xué)成分，這些化學(xué)成分需要進一步研究。

在2020年第七版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》[7]中，熱毒寧注射液被推薦用于新型冠狀病毒肺炎的治療。同時，其被列入《甲型H1N1流感診療方案》《登革熱診療指南》《人感染H7N9禽流感診療方案》中[8-10]。但是，在臨床使用熱毒寧注射液的過程中，出現(xiàn)了多種不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為過敏、皮膚損傷，嚴(yán)重時出現(xiàn)過敏性休克[11-12]。熱毒寧注射液除了主要活性成分，還有很多低含量的化合物沒有被報道，而這些物質(zhì)可能導(dǎo)致熱毒寧注射液出現(xiàn)不良反應(yīng)。因此，本文擬采用高靈敏度的質(zhì)譜技術(shù)對熱毒寧注射液中化學(xué)成分進行系統(tǒng)研究不僅有利于其質(zhì)量控制，而且可對過敏原的篩查奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 ?主要儀器

高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）（美國Agilent公司）;Milli-Q Advantage A10系統(tǒng)（美國MILLPORE公司）;ML204/02型精密天平[梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司];KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 ?主要試劑與藥物

新綠原酸（批號DST180130-015，純度為99%）、異綠原酸B（批號DST180130-037，純度為98%）、異綠原酸C（批號DST180210-038，純度為98%）、咖啡酸（批號 MUST-18040102，純度為98%）均購自成都曼思特生物技術(shù)有限公司;綠原酸（批號110753-201415，純度為98%）、異綠原酸A（批號111782-201706，純度為98%）均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇和乙腈（色譜純，德國Merck公司）;甲酸（色譜純，瑞士Fluka-Sigma-Aldrich公司）;熱毒寧注射液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號Z200707）。

2 方法與結(jié)果

2.1 ?色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：XAqua C18 （150 mm×2.1 mm，2.8 μm）色譜柱;乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，1%～29% A，5～15 min，29%～50% A，15～30 min，50%～95% A）;柱溫 30 ℃;檢測波長 280 nm;體積流量0.3 mL/min;進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，負(fù)離子模式（ESI-）檢測;干燥氣體積流量：10 L/min;干燥氣溫度：350 ℃; 鞘氣溫度：350 ℃;鞘氣體積流量：11 L/min;毛細管電壓：3500 V;錐孔電壓：100 V;化合物質(zhì)核比掃描范圍為m/z 100～1700;化合物二級裂解電壓為10～30 eV。熱毒寧注射液的總離子流圖和色譜圖分別見圖1A和1B。

2.2 ?對照品及供試品溶液制備

稱取對照品新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C各10 mg左右，溶解在5 mL的甲醇溶液中，取1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液過0.22 μM的微孔濾膜，裝入液相小瓶中待用。直接吸取1.5 mL熱毒寧注射液過0.22 μM的微孔濾膜，裝入液相小瓶中待用。

2.3 ?對照品質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究

熱毒寧注射液中主要成分為綠原酸類、環(huán)烯醚萜類、有機酸類等化合物。因此，購買6個對照品進行質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究，相同類型的化合物在質(zhì)譜中存在相同的裂解規(guī)律。研究已知化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，從而推測未知類似物的結(jié)構(gòu)。新綠原酸（23）、綠原酸（28）、異綠原酸A（37）、異綠原酸B（38）和異綠原酸C（39）屬于綠原酸類化合物，這種類型的化合物質(zhì)譜裂解有兩個明顯的特征：（1）因綠原酸類化合物結(jié)構(gòu)中存在酯基，在質(zhì)譜中酯基容易斷裂而形成的質(zhì)核比較小而豐度高的碎片離子（相對于母離子）;（2）因化合物結(jié)構(gòu)中存在羥基以及羧基，因此，在二級質(zhì)譜中會出現(xiàn)[M-H2O]-以及[M-CO2]-的碎片離子。以化合物37為例（圖2），因其結(jié)構(gòu)中存在酯基，在質(zhì)譜中酯基容易斷裂而形成高豐度的m/z 353.090 4、191.056 9和179.036 0碎片離子。碎片離子m/z 353.090 4和191.056 9會繼續(xù)失去一分子H2O而形成m/z 335.079 1和173.046 4的碎片離子。因碎片離子m/z 179.036 0結(jié)構(gòu)中含有羧基，容易失去一分子CO2而形成m/z 135.045 7的碎片離子。

咖啡酸（30，m/z 179.040 7[M-H]-）屬于有機酸類化合物，其質(zhì)譜裂解有如下特征：因其結(jié)構(gòu)中存在大-π共軛系統(tǒng)，因此其骨架很難裂解，主要出現(xiàn)取代基的丟失。因其結(jié)構(gòu)中存在羧基，會失去一分子CO2而形成m/z 135.044 6的碎片離子;因其結(jié)構(gòu)中存在鄰二酚羥基，容易失去一分子H2O而形成m/z 161.026 8的碎片離子。環(huán)烯醚萜類化合物因未購買相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品，沒有對其二級質(zhì)譜裂解規(guī)律進行研究，其質(zhì)譜裂解主要有如下特征：（1）會失去所有的糖基從而形成基本的母核離子;（2）因環(huán)烯醚萜類化合物結(jié)構(gòu)中不存在大-π共軛系統(tǒng)，因此會發(fā)生骨架的裂解，如RDA裂解等[13-14]。

2.4 ?熱毒寧注射液中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定

基于上述質(zhì)譜裂解規(guī)律結(jié)合HPLC-Q-TOF-MS對熱毒寧注射液中主要活性成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，共鑒定化合物40個，包括14個綠原酸類化合物、13環(huán)烯醚萜類化合物、13有機酸類等化合物，其中24個化合物首次在熱毒寧注射液報道。具體結(jié)構(gòu)解析過程如下。

2.4.1 ?綠原酸類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 ?根據(jù)綠原酸類化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律與化合物的二級質(zhì)譜，化合物14-16、23、28、29、32、33、35-40被鑒定為綠原酸類化合物（表1）。以化合物40的結(jié)構(gòu)解析為例，化合物40的質(zhì)核比為m/z 659.176 8，推測其分子式為C35H32O13，從化合物40的二級質(zhì)譜可知（圖3A），其存在m/z 515.131 8、353.098 0、191.062 2和161.050 4的碎片離子，說明其結(jié)構(gòu)中的一部分為異綠原酸?；衔?0的母離子（m/z 659.176 8）會失去一分子對甲基苯乙酸基團從而形成m/z 515.131 8的碎片離子，說明化合物40是由異綠原酸和對甲基苯乙酸組合而成，因此，化合物40被鑒定為異綠原酸E（圖3A）。在化合物40的二級質(zhì)譜，其母離子（m/z 659.176 8）會失去一分子咖啡酸基團從而形成m/z 497.143 1的分子離子，說明化合物40結(jié)構(gòu)推測的正確性。通過相同的方法，其他13個綠原酸類化合物被初步鑒定（表1），化合物23、28、30、37-39通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間、一級質(zhì)譜與二級質(zhì)譜的比對，分別準(zhǔn)確鑒定為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C?；衔?4-16、32、33、35、36和40首次在熱毒寧注射液中報道。

2.4.2 ?環(huán)烯醚萜類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 ?根據(jù)環(huán)烯醚萜類化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律與化合物的二級質(zhì)譜，化合物8、10、17-22、24、26、27、31和34被鑒定為環(huán)烯醚萜類化合物（表1）。以化合物17的結(jié)構(gòu)解析為例，化合物17的質(zhì)核比為m/z 373.123 7，推測其分子式為C16H22O10，從化合物17的二級質(zhì)譜可知（圖3B），化合物17的母離子（m/z 373.123 7）會失去一分子葡萄糖基團從而形成m/z 211.067 5的骨架碎片離子，說明化合物17中含有一分子葡萄糖基。質(zhì)核比為m/z 211.067 5的碎片離子會繼續(xù)丟失一分子H2O或者一分子CO2從而形成m/z 193.056 0或167.076 5的碎片離子，m/z 167.076 5的碎片離子會繼續(xù)丟失一分子H2O，以上質(zhì)譜裂解特征說明化合物17中含有羥基以及羧基。分子離子峰m/z 123.049 7則來源于的m/z 149.065 6的碎片離子發(fā)生RDA裂解。通過化合物17的質(zhì)譜裂解特征、環(huán)烯醚萜類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律以及參考相關(guān)文獻[13，15]， 化合物17被初步鑒定為京尼平酸苷。通過相同的方法，其他12個環(huán)烯醚萜類化合物被初步鑒定（表1），其中化合物10、21、22、26和31首次在熱毒寧注射液報道。

2.4.3 ?有機酸類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 ?化合物1-7、9、11-13、25和30被鑒定為有機酸類化合物（表1）。以化合物1的結(jié)構(gòu)解析為例，化合物1的質(zhì)核比為m/z 191.026 1，推測其分子式為C7H12O6，從化合物1的二級質(zhì)譜可知（圖3C），化合物1的母離子（m/z 191.026 1）會失去一分子H2O或者一分子CO2從而形成m/z 173.014 8或147.035 2的碎片離子，說明化合物1中含有羥基和羧基。質(zhì)核比為m/z 147.035 2的碎片離子會繼續(xù)丟失兩分子H2O從而形成m/z 111.013 5的分子離子峰，說明化合物1的結(jié)構(gòu)中至少存在兩個羥基。化合物1的母離子（m/z

191.026 1）會連續(xù)失去兩分子H2O也驗證了上述結(jié)論。通過化合物1的質(zhì)譜裂解特征及參考相關(guān)文獻[15]，化合物1被初步鑒定為喹啉酸。通過相同的方法，其他12個有機酸類化合物被初步鑒定（表1），化合物30通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間、一級質(zhì)譜與二級質(zhì)譜的比對，準(zhǔn)確鑒定為咖啡酸。其中化合物2-7、9、11-13和25首次在熱毒寧注射液報道。

3 討論

HPLC-Q-TOF-MS因其檢測限低、靈敏度高、重復(fù)性好而廣泛應(yīng)用于中藥材、中成藥、中藥注射劑中主要活性成分的定性研究[16-18]。特別是對于一些含量很低、極性較大、無紫外吸收的化合物結(jié)構(gòu)鑒定具有優(yōu)勢。在本研究中，利用HPLC-Q-TOF-MS共鑒定了熱毒寧注射液40個化合物，其中大部分屬于極性較大和無紫外吸收的化合物，這些化合物使用傳統(tǒng)植物化學(xué)分離難度較大，難以被分離純化。HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)能夠確定化合物的骨架和取代基，但是卻無法確定骨架與取代基的連接位點[19-20]。因此，除了新綠原酸（23）、綠原酸（28）、咖啡酸（30）、異綠原酸A（37）、異綠原酸B（38）和異綠原酸C（39）被準(zhǔn)確鑒定外，其他化合物均為初步鑒定。

中藥注射劑作為現(xiàn)代中藥新劑型，具有起效迅速、生物利用度高等優(yōu)點，為中藥在防治危急重癥疾病中開辟了新途徑[21]。但是，中藥注射劑的不良反應(yīng)嚴(yán)重阻礙了其快速發(fā)展，主要原因是中藥注射劑成分過于復(fù)雜，對于引起不良反應(yīng)的物質(zhì)難以鑒定。在臨床上，熱毒寧注射液的主要不良反應(yīng)為速發(fā)型的皮膚過敏，表現(xiàn)為皮膚瘙癢和斑丘疹等，但是過敏源卻鮮有報道[11-12]。在本研究中，從熱毒寧注射液中共鑒定了40個化合物，除了京尼平酸苷（17）、新綠原酸（23）、斷馬錢子酸（27）綠原酸（28）、咖啡酸（30）、異綠原酸A（37）、異綠原酸B（38）和異綠原酸C（39）等高含量的化合物以外，其他化合物含量相對較低，而這一些化合物均有可能為熱毒寧注射液致敏因子，本研究為熱毒寧注射液致敏因子的發(fā)現(xiàn)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，也可以考慮將京尼平酸苷、新綠原酸、斷馬錢子酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等熱毒寧注射液中的主要成分與熱毒寧注射液進行等效性研究，以期排除熱毒寧注射液中的致敏因子，為熱毒寧注射液的快速發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

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〔收稿日期〕2021-09-01

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金面上項目（82174069）;湖南省教育廳科學(xué)研究重點項目（18A216）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)一流學(xué)科開放基金重點項目（2021YX02）。

〔作者簡介〕徐玉琴，女，碩士，研究方向：中藥及復(fù)方制劑中藥化學(xué)成分鑒定。

〔通信作者〕*劉紅宇，女，博士，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：lhy9544@163.com。