紅曲發(fā)酵藜麥種子液培養(yǎng)及固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

賀圣凌，林雨蝶，鄧茹月，周羅娜，趙興麗，羅林麗，周玉鋒*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴陽(yáng) 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550006；3.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，貴陽(yáng) 550006)

藜麥(Chenopodiumquinoa)為莧科的藜亞科藜屬(ChenopodiumL.)植物，是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的安第斯原始假性谷物，與傳統(tǒng)谷物相比具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在安第斯山地區(qū)已有超過(guò)7000年的種植歷史，是古印加民族的主要糧食作物之一，藜麥蛋白質(zhì)含量較高，優(yōu)于中國(guó)食物成分表公布的其他谷物，藜麥中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、維生素等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分，而且含有多酚、黃酮、皂苷等生理活性物質(zhì)[1-6]，2020年，陳志婧等[7]對(duì)藜麥的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行對(duì)比分析，證實(shí)藜麥含有豐富的礦質(zhì)元素，其K、Ca、Cu、Mg的含量都高于小麥、水稻和小米。2019年，翁正杭等[8]對(duì)金針菇在藜麥固態(tài)培養(yǎng)基上的發(fā)酵條件進(jìn)行了探討，表明藜麥可以為金針菇提供充足的碳源及氮源。目前，藜麥的食用方式主要以粥類為主，2020年，梁霞等[9]研究了藜麥八寶粥的制備工藝，樂(lè)梨慶等[10]研發(fā)了藜麥奇亞籽沖調(diào)粉，和麗媛[11]研發(fā)了紅薯藜麥餅干，閆志鵬[12]研制了藜麥姜汁酸奶。除了在食用方面，藜麥也開(kāi)始應(yīng)用于化妝品，2020年，丁瑞瑞等[13]研究了藜麥淀粉微球的制備。紅曲菌作為藥食兩用絲狀真菌，在中國(guó)已有1000多年的歷史。使用紅曲菌能產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如紅曲色素、莫納可林K (Monacolin K,MK)、γ-氨基丁酸(GABA)等，其中部分代謝產(chǎn)物具有降血壓、降血脂、抗菌、抗氧化和抗癌等重要的生理活性[14-15]。紅曲菌不僅作為米制品發(fā)酵，也常用于釀酒工藝中，2020年，李富強(qiáng)等[16]證實(shí)了紅曲菌應(yīng)用于釀酒可以明顯提升原酒質(zhì)量。2016年，馬帥等[17]利用紅曲發(fā)酵豆?jié){成功生產(chǎn)Monacolin K。紅曲還常用于中藥研究，2016年，楊靜云[18]利用山楂、澤瀉、決明子與紅曲霉混合發(fā)酵制備了降脂中藥。目前，藜麥發(fā)酵食品極少，而紅曲菌的功效廣泛，若能選擇紅曲菌發(fā)酵藜麥，將益生菌與高營(yíng)養(yǎng)食物相結(jié)合，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，為藜麥開(kāi)發(fā)功能性發(fā)酵食品提供了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：紅藜麥：產(chǎn)自山西忻州，由繁峙縣玥晨貿(mào)易有限公司提供。

菌種：紫紅曲霉3.4629(Monascuspurpureus)，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

試劑：蛋白胨(BS)、蔗糖(AR)、硫酸鎂(AR)、PDA培養(yǎng)基(BR)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(BR)、無(wú)水乙醇(AR)。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch2酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；GI100DP型立式壓力蒸汽滅菌鍋 致微(廈門(mén))儀器有限公司；BSD-YX3400搖床、BSP-250生化培養(yǎng)箱 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SJ-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲菌孢子懸浮液的制備

取活化好的紅曲菌斜面試管，在無(wú)菌操作臺(tái)加上入無(wú)菌水，用接種環(huán)輕輕刮取瓊脂表面，使其孢子被順利刮下，將孢子懸浮液置于帶玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，充分振蕩，用無(wú)菌濾紙過(guò)濾，再以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確保孢子濃度達(dá)106個(gè)/mL。

1.3.2 紅曲發(fā)酵藜麥種子液培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以藜麥添加量為100 g/L、蔗糖(碳源)添加量為30 g/L、蛋白胨(氮源)添加量為30 g/L、硫酸鎂(無(wú)機(jī)鹽)添加量為1 g/L配制藜麥種子液，分別以接種量、初始pH值、裝液量為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.2.1 接種量對(duì)種子液培養(yǎng)的影響

將配制好的種子液50 mL置于250 mL三角瓶中，種子液的初始pH值為自然值，分別按5%、10%、15%、20%、25%的接種量接入紅曲菌孢子懸浮液，溫度為30 ℃，于轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng)5 d，測(cè)定種子液的菌體干重。

1.3.2.2 初始pH值對(duì)種子液培養(yǎng)的影響

將配制好的藜麥種子液50 mL置于250 mL三角瓶中，按10%的接種量接入紅曲菌孢子懸浮液，分別調(diào)節(jié)初始pH值為3，4，5，6，7，溫度為30 ℃，于轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng)5 d，測(cè)定種子液的菌體干重。

1.3.2.3 裝液量對(duì)種子液培養(yǎng)的影響

分別量取配制好的藜麥種子液30，40，50，60，70，80 mL于250 mL三角瓶中，按10%的接種量接入紅曲菌孢子懸浮液，種子液初始pH值為自然值，溫度為30 ℃，于轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng)5 d，測(cè)定種子液的菌體干重。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)以接種量、初始pH值和裝液量為因素，以菌體干重為評(píng)定指標(biāo)的正交試驗(yàn)，綜合分析單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)三因素四水平正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)，對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析及方差分析，篩選出最優(yōu)種子液培養(yǎng)條件。

表1 種子液正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment of seed liquid

1.3.3 藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

根據(jù)1.3.2試驗(yàn)結(jié)論培養(yǎng)最優(yōu)藜麥-紅曲種子液，分別以蒸料時(shí)間、接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3.1 蒸料時(shí)間對(duì)藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，以料液比為1∶1加入蒸餾水，分別于105 ℃蒸煮20，30，40，50，60 min，按10%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻，于31 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其色價(jià)。

1.3.3.2 接種量對(duì)藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，以料液比為1∶1加入蒸餾水，于105 ℃蒸煮30 min，分別按5%、10%、15%、20%、25%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻，于31 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其色價(jià)。

1.3.3.3 料液比對(duì)藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，分別以料液比為1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4加入蒸餾水，于105 ℃蒸煮30 min，按10%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻，于31 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其色價(jià)。

1.3.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，以料液比為1∶1加入蒸餾水，于105 ℃蒸煮30 min，按10%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻，分別于31 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6，7，8，9，10 d，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其色價(jià)。

1.3.3.5 發(fā)酵溫度對(duì)藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，以料液比為1∶1加入蒸餾水，于105 ℃蒸煮30 min，按10%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻，分別于25，28，31，34，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其色價(jià)。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)以蒸料時(shí)間、接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為因素，以色價(jià)為評(píng)定指標(biāo)的正交試驗(yàn)，綜合分析單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)五因素五水平正交試驗(yàn)(見(jiàn)表2)，對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析及方差分析，篩選出最優(yōu)藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件。

盡管自我表露大部分是建立在親密關(guān)系的基礎(chǔ)上[23]，但有關(guān)研究表明，網(wǎng)絡(luò)交互以及其他以互聯(lián)網(wǎng)為基礎(chǔ)的溝通都可以促使用戶進(jìn)行較高程度的自我表露。例如，Rheingold (2001) 的研究表明，許多人會(huì)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)空間的溝通建立新的有意義的聯(lián)系，相對(duì)于傳統(tǒng)的面對(duì)面聊天而言，借助“媒介”進(jìn)行溝通會(huì)使得人們很自然地向他人呈現(xiàn)出自己更為私密的信息。

表2 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment of solid-state fermentation

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，使用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲發(fā)酵藜麥種子液培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖1可知，不同紅曲菌孢子懸浮液的接種量對(duì)種子液培養(yǎng)中菌體干重的影響顯著，當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌體干重為0.023 g/mL，當(dāng)接種量為10%時(shí)，菌體干重提升至0.049 g/mL，但當(dāng)菌體接種量提升至15%時(shí)，菌體干重反而降低至0.042 g/mL，隨著菌體接種量繼續(xù)提升，菌體干重繼續(xù)略微降低，但當(dāng)接種量繼續(xù)提升至25%時(shí)，菌體干重大幅度降低至0.034 g/mL。這可能是由于菌體接種量過(guò)大，培養(yǎng)體系內(nèi)養(yǎng)分有限，經(jīng)過(guò)較短時(shí)間的生長(zhǎng)繁殖后，菌群迅速進(jìn)入衰亡期，因而導(dǎo)致接種量過(guò)高、菌體干重過(guò)低的情況發(fā)生。

圖1 接種量對(duì)種子液培養(yǎng)的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on seed liquid culture

續(xù) 表

由圖2可知，不同的初始pH值對(duì)種子液培養(yǎng)情況的影響也較為顯著，當(dāng)初始pH值為3時(shí)，菌體干重為0.043 g/mL，當(dāng)初始pH值為4時(shí)，菌體干重略微上升至0.045 g/mL，當(dāng)初始pH值為5時(shí)，菌體干重顯著上升至0.050 g/mL，而當(dāng)初始pH值為6和7時(shí)，菌體干重則顯著下降，因?yàn)榧t曲菌是嗜酸喜醇的好氧菌，通常最適pH值在4～5之間，而在最適范圍內(nèi)，細(xì)胞酶活性較高，菌體生長(zhǎng)速率也較高，故當(dāng)pH值酸性降低時(shí)，紅曲菌的繁殖能力降低。

圖2 初始pH值對(duì)種子液培養(yǎng)的影響Fig.2 Effect of initial pH value on seed liquid culture

由圖3可知，裝液量對(duì)種子液培養(yǎng)的影響也較顯著，裝液量由30 mL增加至40 mL時(shí)，菌體干重由0.045 g/mL降至0.040 g/mL，但當(dāng)裝液量為50 mL時(shí)，菌體干重最高，達(dá)0.048 g/mL，之后隨著裝液量的增加，菌體干重降低，因?yàn)楫?dāng)裝液量較低時(shí)，為菌體提供的培養(yǎng)體系養(yǎng)分有限，但當(dāng)裝液量過(guò)高時(shí)，溶氧量降低，對(duì)于好氧紅曲菌而言，會(huì)影響菌體代謝，導(dǎo)致菌體的繁殖能力降低。

圖3 裝液量對(duì)種子液培養(yǎng)的影響Fig.3 Effect of liquid amount on seed liquid culture

在接種量、初始pH值及裝液量等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定了以菌體干重為評(píng)定指標(biāo)的三因素四水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表3。

表3 種子液正交試驗(yàn)表Table 3 The orthogonal test of seed liquid

由表3可知，主次順序?yàn)锽>A>C，說(shuō)明初始pH值對(duì)種子液菌體生長(zhǎng)的影響最大，其次是接種量，再次是裝液量，試驗(yàn)因素的最優(yōu)組合為A3B3C1，即種子液的最佳培養(yǎng)條件為接種量20%，初始pH值5，裝液量30 mL/250 mL。用最優(yōu)組合方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得菌體干重為57.13 g/L，優(yōu)于各正交試驗(yàn)。

根據(jù)表3中正交試驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 種子液正交試驗(yàn)方差分析表 Table 4 ANOVA of orthogonal test of seed liquid

由表4方差分析可知，初始pH值對(duì)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)的影響極顯著(P<0.01)，接種量和裝液量的影響不顯著(P>0.05)，但3個(gè)因素影響程度的大小排序與表3中極差分析結(jié)果一致，均是B>A>C。

2.2 藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖4可知，接種量對(duì)固態(tài)發(fā)酵后色價(jià)的影響顯著，接種量分別為5%和20%時(shí)，其色價(jià)較高，且在5%～25%之間，色價(jià)波動(dòng)較大，故選擇5%、10%、15%、20%、25%為因素水平。

圖4 接種量對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on solid-state fermentation

由圖5可知，料液比對(duì)固態(tài)發(fā)酵色價(jià)的影響也較為顯著，當(dāng)料液比為1∶1.2時(shí)，色價(jià)最低(1.112 U/g)，當(dāng)料液比為1∶0.8時(shí)，色價(jià)最高，為16.617 U/g，二者之間的差距極大，隨著料液比的降低，發(fā)酵物的色價(jià)波動(dòng)較大，故選擇1∶0.6～1∶1.4為因素水平。

圖5 料液比對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on solid-state fermentation

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，色價(jià)出現(xiàn)不同程度的上升，直到第10天，色價(jià)略微降低。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of fermentation time on solid-state fermentation

由圖7可知，發(fā)酵溫度在31 ℃時(shí)，色價(jià)極顯著高于其他溫度。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on solid-state fermentation

由圖8可知，蒸料時(shí)間在40 min時(shí)色價(jià)最高，蒸料時(shí)間在50 min時(shí)色價(jià)最低，當(dāng)蒸料時(shí)間繼續(xù)增加至60 min時(shí)，色價(jià)又出現(xiàn)顯著提升的趨勢(shì)。通過(guò)單因素試驗(yàn)，為后續(xù)的正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)提供了因素及水平。

圖8 蒸料時(shí)間對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of steaming time on solid-state fermentation

續(xù) 表

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

在蒸料時(shí)間、接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定了以色價(jià)為評(píng)定指標(biāo)的五因素五水平正交試驗(yàn)(見(jiàn)表2)，其正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表5。

表5 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)表Table 5 The orthogonal test of solid-state fermentation

由表5中的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析可知，主次順序?yàn)镋>D>A>B>C，說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)固體發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)的影響最大，隨后依次是發(fā)酵時(shí)間、蒸料時(shí)間、接種量和料液比，根據(jù)k值和R值可確定試驗(yàn)因素的最優(yōu)組合為A4B3C3D5E3，即藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件為蒸料時(shí)間為50 min，接種量為15%，料液比為1∶1，發(fā)酵時(shí)間為10 d，發(fā)酵溫度為31 ℃。

根據(jù)表5的正交試驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS 20軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)方差分析表Table 6 ANOVA of orthogonal test of solid-state fermentation

由表6方差分析可知，發(fā)酵溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響表現(xiàn)為顯著(P<0.05)，其余4個(gè)因素對(duì)固態(tài)發(fā)酵影響不顯著(P>0.05)。5個(gè)因素對(duì)藜麥-紅曲固態(tài)發(fā)酵影響程度的大小排序?yàn)镋>A>D>B>C，該排列順序與極差分析大致一致，但存在不同，在極差分析中發(fā)酵時(shí)間的影響程度大于蒸料時(shí)間，但在方差分析中蒸料時(shí)間的影響程度大于發(fā)酵時(shí)間，但一般認(rèn)為方差分析結(jié)果比極差分析更精準(zhǔn)，極差分析主觀性較強(qiáng)，極差只指明了測(cè)定值的最大離散范圍，而未能利用全部測(cè)量值的信息，故此試驗(yàn)以方差分析結(jié)果為準(zhǔn)。

3 結(jié)論

藜麥被FAO認(rèn)定為唯一一種單作物即可滿足人類所需的全部營(yíng)養(yǎng)的糧食[19-20]，毋庸置疑，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，但目前藜麥的食用方法極少。紅曲菌具有一定的抗“三高”功效，且其次級(jí)代謝產(chǎn)物也具有抗氧化活性。本文首次提出將益生菌紅曲菌與藜麥相結(jié)合，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化進(jìn)一步提高藜麥的食用價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，探究紅曲發(fā)酵藜麥種子液的培養(yǎng)條件及固態(tài)發(fā)酵條件，當(dāng)接種量為30%，初始pH值為5、裝液量為30 mL/250 mL時(shí)種子液菌體生長(zhǎng)情況最優(yōu)，菌體重量達(dá)57.13 g/L，當(dāng)蒸料時(shí)間為50 min，接種量為15%，料液比為1∶1，發(fā)酵時(shí)間10 d，發(fā)酵溫度為31 ℃時(shí)，紅曲-藜麥固態(tài)發(fā)酵菌體色價(jià)最優(yōu)，達(dá)11.12 U/g。通過(guò)該試驗(yàn)方案，可為后期開(kāi)發(fā)藜麥發(fā)酵食品提供基礎(chǔ)，進(jìn)一步提高藜麥的可食用性。