果膠酶法提取紫甘藍(lán)花青素工藝條件研究

唐 功，何 敏，王仕英，嬴 河，鄭貴鳳，沙馬爾的木，李毛卓改

（阿壩師范學(xué)院，化學(xué)化工與生命科學(xué)系，四川 汶川縣水磨鎮(zhèn)623003）

果膠酶法提取紫甘藍(lán)花青素工藝條件研究

唐 功，何 敏，王仕英，嬴 河，鄭貴鳳，沙馬爾的木，李毛卓改

（阿壩師范學(xué)院，化學(xué)化工與生命科學(xué)系，四川 汶川縣水磨鎮(zhèn)623003）

文章探索了果膠酶法提取紫甘藍(lán)花青素的工藝條件.采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法研究不同因素即pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶量和料液比對(duì)花青素提取的影響.最佳提取條件是：加酶量0.7%、pH＝4、酶解時(shí)間是60min、料液比1︰10、酶解溫度40℃.果膠酶法提取紫甘藍(lán)花青素的色價(jià)是普通乙醇溶劑法提取的15倍，這為花青素提取技術(shù)的研究提供理論參數(shù)支持.

果膠酶；花青素；提取工藝

紫甘藍(lán)俗稱紫包菜，是結(jié)球甘藍(lán)中的一個(gè)變種.它的葉片呈紫紅色，表面有灰白色蠟粉，其中富含花青素，雖然它不是人體必需的營(yíng)養(yǎng)素，但確是最常見(jiàn)的抗氧化物質(zhì)之一［1］，對(duì)于預(yù)防衰老和相關(guān)的疾病很有幫助.各國(guó)學(xué)者對(duì)不同來(lái)源的植物原花青素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)紫甘藍(lán)中的花青素具有預(yù)防心臟疾?。?］、心血管疾?。?］、抗氧化［4］等功能，將其開(kāi)發(fā)利用有可能成為一種有價(jià)值的天然色素資源.

目前，研究紫甘藍(lán)花青素提取工藝的文獻(xiàn)不多，大多采用傳統(tǒng)的浸提法［5－6］、微波輻射法和超聲波輔助法［7］.但是在天然食用色素提取中，由于天然色素一般在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下發(fā)生變化或分解，而酶輔助提取技術(shù)具有專一性強(qiáng)、條件溫和、反應(yīng)過(guò)程容易控制［8］等眾多優(yōu)勢(shì)，所以酶解法更適合于天然食用色素的提取.本試驗(yàn)主要研究的是果膠酶法提取紫甘藍(lán)花青素最佳條件，包括pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間和料液比，為紫甘藍(lán)花青素提取技術(shù)的研究提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘藍(lán)：汶川縣水磨鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買；試劑：果膠酶10u／mg，購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠；鹽酸、無(wú)水乙醇（均為分析純）.

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、電熱恒溫干燥箱、筆式酸度計(jì)、電子天平、離心機(jī).

1.3 方法

1.3.1 紫甘藍(lán)花青素提取液的制備

將購(gòu)于市場(chǎng)的紫甘藍(lán)放入80℃的恒溫箱中進(jìn)行24小時(shí)烘干→粉碎→加入提取液→調(diào)節(jié)pH值→加入果膠酶，電動(dòng)攪拌輔助酶解60min→酶解液4 000r／min離心30min后抽濾取上清液→花青素提取液.

1.3.2 單因素試驗(yàn)

稱取一定質(zhì)量的紫甘藍(lán)粉末于三角瓶?jī)?nèi)，調(diào)節(jié)pH值后加入果膠酶，放入水浴鍋中.在一定溫度下攪拌一段時(shí)間后加入乙醇浸提，然后將瓶?jī)?nèi)溶液以4 000r／min轉(zhuǎn)速離心30min，取部分所得上清液，在530nm處測(cè)定其吸光度，進(jìn)而計(jì)算花青素色價(jià).分別考察pH值、酶解溫度、加酶量、底物濃度、酶解時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取效率的影響.

1.3.3 紫甘藍(lán)花青素含量的檢測(cè)

空白對(duì)照的制備：相應(yīng)體積的蒸餾水.

參照楊朝霞［9］的色價(jià)測(cè)定方法，以上述空白樣做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)530nm下對(duì)花青素溶液進(jìn)行吸光度檢測(cè)，并計(jì)算色價(jià).

色價(jià)表達(dá)式為：E1cm1%＝（A／W）×K.

式中：E1cm1%為色價(jià)；A為吸光度；W為樣品質(zhì)量／g；K為稀釋倍數(shù).

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，因素和水平見(jiàn)表1.

表1 果膠酶提取條件正交水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

固定條件為酶解pH＝4，酶解溫度為40℃，加酶量0.7%，料液比為1︰10，酶解時(shí)間60min.在其他條件不變的情況下分別考察酶解pH值、酶解溫度、加酶量、料液比、酶解時(shí)間對(duì)花青素提取效率的影響，根據(jù)花青素提取液的色價(jià)大小確定最佳提取條件.

2.1.1 pH值對(duì)花青素色價(jià)的影響

酶解pH值梯度設(shè)置為4.0、5.0、6.0、7.0，酶解后測(cè)其分光光度值，并計(jì)算色價(jià).根據(jù)色價(jià)大小確定最佳酶解pH值，結(jié)果如圖1所示.

圖1 pH對(duì)酶解提取紫甘藍(lán)花青素色價(jià)的影響

由圖1可知，紫甘藍(lán)花青素溶液色價(jià)隨pH值增大而減小.在pH＝4時(shí)有最大的值，因此pH值的升高不利于酶解提取紫甘藍(lán)花青素.pH值對(duì)酶解助提取效率影響主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面是pH值的大小影響紫甘藍(lán)花青素在水中的溶解度；另一方面是pH值的大小影響果膠酶酶解紫甘藍(lán)細(xì)胞壁，從而影響花色苷的流出.

綜上所得，在pH＝4時(shí)花青素色價(jià)最大，此時(shí)為最佳提取的pH值.

2.1.2 酶解溫度對(duì)花青素色價(jià)的影響

將酶解溫度梯度設(shè)置為20℃、30℃、40℃、50℃，酶解后測(cè)其分光光度值，并計(jì)算色價(jià)，根據(jù)色價(jià)大小來(lái)確定最適酶解溫度，結(jié)果如圖2.

圖2 酶解溫度對(duì)酶解提取紫甘藍(lán)花青素色價(jià)的影響

由圖2知，從總體趨勢(shì)來(lái)看，紫甘藍(lán)花青素色價(jià)在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而升高，直到酶的活性達(dá)到最大，但超過(guò)40℃時(shí)色價(jià)隨溫度的升高反而降低.因?yàn)槊傅幕钚圆坏粫?huì)升高反而會(huì)下降，最后導(dǎo)致酶失活.由圖2可知，溫度40℃為提取的最適溫度.

2.1.3 加酶量對(duì)花青素色價(jià)的影響

將加酶量的梯度設(shè)置為0.2%、0.7%、1.2%、1.7%，酶解后測(cè)其分光光度值，并計(jì)算色價(jià)，根據(jù)色價(jià)大小來(lái)確定最佳加酶量，結(jié)果如圖3.

圖3 加酶量對(duì)酶解提取紫甘藍(lán)花青素色價(jià)的影響

由圖3可知，隨著酶量的增加色價(jià)不斷增大，當(dāng)酶量達(dá)到0.70%后色價(jià)增大不明顯.但當(dāng)酶解到一定程度時(shí)，隨著酶量增大，紫甘藍(lán)的細(xì)胞壁破壞就越厲害，也就越不利于花青素的提取，因此確定最佳的加酶量為0.70%.

2.1.4 料液比對(duì)花青素色價(jià)的影響

將料液比的梯度設(shè)置為1︰5、1︰10、1︰15、1︰20，酶解后測(cè)其分光光度值，并計(jì)算色價(jià)，根據(jù)色價(jià)來(lái)確定最佳料液比，結(jié)果如圖4.

圖4 料液比對(duì)酶解提取紫甘藍(lán)花青素色價(jià)的影響

由圖4可知，料液比在1︰10時(shí)色價(jià)最高，之后隨著料液比的增加花青素的色價(jià)反而下降.這表明提取劑的增加不利于酶解提取花青素，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定酶解料液比為1︰10.

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)花青素色價(jià)的影響

將酶解時(shí)間梯度設(shè)置為30min、60min、90min、120min，酶解后測(cè)其分光光度值，再計(jì)算色價(jià)，根據(jù)色價(jià)大小來(lái)確定最佳酶解時(shí)間，結(jié)果如圖5.

圖5 酶解時(shí)間對(duì)酶解提取紫甘藍(lán)花青素色價(jià)的影響

由圖5可知，在60min的時(shí)候色價(jià)是最高的.隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素色價(jià)呈現(xiàn)下降趨勢(shì).因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶解反應(yīng)逐漸結(jié)束，所以色價(jià)降低.由圖5可知，在提取時(shí)間為60min時(shí)色價(jià)最高，可以確定為最佳酶解提取時(shí)間.

表2 果膠酶助提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn).根據(jù)表1設(shè)置的條件進(jìn)行酶解提取，表2為果膠酶助提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果.

根據(jù)表2判斷，5個(gè)因素對(duì)紫甘藍(lán)花青素色價(jià)的影響順序?yàn)椋篊＞A＞E＞D＞B，最優(yōu)提取條件為A1B3C2D2E2，即酶解提取pH＝4、酶解溫度為40℃、加酶量為0.7%、料液比為1︰10、酶解時(shí)間為60min.

通過(guò)SPSS13.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3.

表3 正交試驗(yàn)方差分析

由表3可見(jiàn)，5因素中對(duì)試驗(yàn)有顯著影響的是加酶量和pH值，較為顯著影響的是酶解時(shí)間、料液比，不顯著的是酶解溫度.影響順序與表2相同，即最佳提取工藝為A1B3C2D2E2.

2.3 酶法提取花青素的驗(yàn)證試驗(yàn)

果膠酶優(yōu)化提取與同條件乙醇溶劑法提取結(jié)果比較：在相同條件下（pH值為4、料液比為1︰10、提取溫度為40℃、提取時(shí)間為60min）分別在果膠酶酶解和乙醇溶劑中進(jìn)行試驗(yàn)，做2次驗(yàn)證試驗(yàn)，在530nm處測(cè)取吸光度并計(jì)算出花青素的色價(jià)，結(jié)果如表4.

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表3可見(jiàn)，酶解法提取的色價(jià)是溶劑法提取的15倍.因此，用果膠酶法提取紫甘藍(lán)的花青素可以減少溶劑污染，同時(shí)可提高提取效率，同傳統(tǒng)溶劑法相比能夠節(jié)約資源，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的可行性.

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)果表明，果膠酶法提取紫甘藍(lán)中花青素的最佳工藝條件為加酶量0.7%、pH＝4的酸性乙醇、酶解時(shí)間是60min、料液比1︰10、酶解溫度是40℃.果膠酶法提取紫甘藍(lán)花青素色價(jià)是溶劑法提取的15倍.通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)證明，酶解法提取紫甘藍(lán)花青素既可以減少溶劑污染，同時(shí)又提高了提取的效率，它為紫甘藍(lán)花青素的提取提供了一條新途徑，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值，為紫甘藍(lán)色素的開(kāi)發(fā)利用提供了參考.

［1］Takuro K，Kciko M，Kaoru N，et al.Increase of antioxidative protentian of rat plasma by oral administration of proanthocyanidin－rich extract from rape seeds［J］.Agric Food Chen，1999，47（5）：1892-1897.

［2］Sanoner P，Guyot S，Marnet N，et al.Polyphenol profiles of French cider apple varieties（Malus domestica sp.）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（12）：4847-4853.

［3］Frankel E N，Kanner J，et al.Inhibition of oxidation of humanlow-density lipoprotein by phenolic substances in red wine［J］.Lancet，1993，341（8843）：454-457.

［4］Jorge M，RicardoI D，Jacques R，et al.Procyahidins dimmersand trimers from grape seeds［J］.Phytochemistry，1991，30（4）：1259-1264.

［5］王燕霞.傳統(tǒng)水浴提取紫甘藍(lán)紅色素工藝研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28（1）：119-122.

［6］張玉敏，郭艷華，陳義鋒.紫甘藍(lán)色素最佳提取工藝條件的研究［J］.華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，40（2）：209－212.

［7］王歡.紫甘藍(lán)色素最佳提取工藝條件的研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32（12）：229-233.

［8］程賢，畢良武，趙振東等.酶輔助提取技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.生物質(zhì)化學(xué)工程，2016，50（03）：71-75.

［9］楊朝霞.紫甘薯花色苷色素提取純化工藝研究及組分分析［D］.青島：青島大學(xué)，2004.

Study on Extraction Conditions of Pectinase Anthocyanins of Purple Cabbage

TANG Gong，HE Min，WANG Shi－ying，YIN He，ZHENG Gui-feng，SHA Ma-er-di-mu，LI Mao-zhuo-gai
（Department of Chemistry and Life Science，Aba Normal University，Wenchuan 623002，China）

Objective The present study aimed to explore the extraction of purple cabbage anthocyanin with a pectinase method.Methods The single factor test and orthogonal test were used to study the effects of different factors，namely pH value，temperature，time，pectinase amount and solid-liquid ratio on the extraction of anthocyanins.Results The optimal extraction conditions included 0.7%pectinase，pH＝4，enzymatic hydrolysis time of 60minutes，1：10solid-liquid ratio，the enzyme hydrolysis at 40℃temperature.Conclusion The color value of purple cabbage anthocyanin with pectinase extraction was 15times mire than that of the ordinary extraction with ethanol solvent method.Our results probably provided some theoretical and experimental support for the extraction technology of anthocyanins.

Pectinase；Anthocyanin；Extraction technology；

TQ461

A

1009-2102（2016）03-0001-06

2016－08－02

四川中小學(xué)教師專業(yè)發(fā)展研究中心（TDTR2016－015），校級(jí)教改課題（重點(diǎn)）（JXGG2015－03）.

唐功（1970—），男，甘肅定西人，碩士，副教授，主要從事生物化學(xué)教學(xué)與研究.