廣西產(chǎn)羅漢松葉指紋圖譜研究

陳明偉 韋錦梅 甄丹丹 丘琴 盧顯興 黃秋艷 甄漢深

摘要：【目的】以廣西產(chǎn)羅漢松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don]的葉為研究對(duì)象，建立高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為羅漢松葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)?！痉椒ā坷肏PLC對(duì)廣西產(chǎn)羅漢松葉進(jìn)行指紋圖譜研究，建立共有模式，并進(jìn)行方法學(xué)考察，使用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)10批不同產(chǎn)地羅漢松葉的共有峰進(jìn)行確認(rèn)，對(duì)其相似度進(jìn)行評(píng)價(jià);使用SPSS 21.0，以共有峰原始峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析?！窘Y(jié)果】方法學(xué)考察結(jié)果中，精密度試驗(yàn)主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3%;穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明樣品提取液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定;重復(fù)性試驗(yàn)所有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%;建立羅漢松葉的指紋圖譜，10批不同產(chǎn)地羅漢松葉初步建立其共有模式，標(biāo)定了22個(gè)共有峰，樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度都在0.900以上，相似性良好。在10批羅漢松葉藥材的指紋圖譜中，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯差異。10批羅漢松葉樣品可分為3類：S4為第1類;S3、S2和S1為第2類;S5、S6、S7、S8、S9和S10為第3類。【結(jié)論】建立的羅漢松葉指紋圖譜特征性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，可為羅漢松葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 羅漢松葉;質(zhì)量分析;指紋圖譜;高效液相色譜（HPLC）

中圖分類號(hào)： S791.46;R284.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）08-2078-09

Fingerprint of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don

leaves from Guangxi

CHEN Ming-wei， WEI Jin-mei， ZHEN Dan-dan， QIU Qin*， LU Xian-xing，

HUANG Qiu-yan， ZHEN Han-shen

（Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning ?530200， China）

Abstract：【Objective】The high efficiency liquid chromatography（HPLC） fingerprint was adopted to analyze leaves of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don. from Guangxi，so as to provide a reference for the quality evaluation of leaves of P. macrophyllus. 【Method】HPLC was used to study the fingerprint of P. macrophyllus leaves and the common fingerprint mode was established，the method validation was carried. The similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM（2012.1 edition） was used to calculate the similar degree of common peaks of 10 batches of P. macrophyllus leaves from different places of origins. The SPSS 21.0 statistical software was used to cluster the original peak area data of the common peaks. 【Result】In precision tests，relative standard deviation（RSD） of relative retention time and relative peak area of the major common peaks were less than 3%. RSD of relative peak area in stability tests are all less than 3%，the results showed that the sample extract was stable within 24 h. RSD of the relative retention time of all chromatographic peaks in the reproducibility tests were less than 2%. The fingerprints of the leaves of P. macrophyllus were established. The common fingerprint pattern of 10 batches of P. macrophyllus leaves were initially established，22 common peaks were confirmed. The similarity between the fingerprint of the sample and the control was more than 0.900，the similarity was good. There was no great difference in the relative retention time of the common peaks among 10 batches of P.macrophyllus leaves. The 10 batches of P. macrophyllus leaves could be divided into 3 categories. S4 into the first category，S3，S2 and S1 were grouped into the second category，S5，S6，S7，S8，S9 and S10 were grouped into the third category.【Conclusion】The fingerprint established is characterized，accuracy and reliability，which can provide basis for the quality evaluation of the P. macrophyllus leaves.

Key words： Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don leaves; quality analysis; fingerprint; high efficiency liquid chromatography（HPLC）

Foundation item： Guangxi First-class Discipline Construction Project（2018XK052）; Zhuang and Yao Pharmaceutical Collaborative Innovation Center Project（Guijiaokeyan〔2013〕20）; Guangxi Zhuang and Yao Medicine Key Laboratory Project（Guikejizi〔2014〕32）; Guangxi Key Discipline Zhuang Pharmacy Project（Guijiaokeyan〔2013〕16）

0 引言

【研究意義】羅漢松[Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don]又名羅漢柏、羅漢杉、金錢松、長(zhǎng)青羅漢杉、土杉、仙柏等，為羅漢松科羅漢松屬植物，分布在熱帶、亞熱帶和南溫帶地區(qū)，在廣西地區(qū)常見。羅漢松既可作觀賞植物，又可作藥用植物，其全株均可藥用（吳魯東等，2012;張東峰，2020），其中穗花杉雙黃酮為羅漢松的主要活性成分（黃振青等，2014;楊雨等，2014）。穗花杉雙黃酮是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有多種生物活性的化合物，具有抗炎（黃振青等，2014）、抗微生物（Hwang et al.，2012;Wilsky et al.，2012）、抗輻射（Lee et al.，2012）、抗腫瘤（Bochis et al.，2015;Pan et al.，2017;Lee et al.，2018;王曜暉等，2019）、護(hù)肝（黃振青等，2014）、神經(jīng)保護(hù)（Ishola et al.，2012，2013）及降血糖（鄭曉珂等，2013）等作用。隨著植物類藥物活性單體研究的不斷深入，穗花杉雙黃酮的作用越來(lái)越引起各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注，羅漢松的藥用價(jià)值也顯示出更廣闊的前景。因此，以穗花杉雙黃酮為主成分，建立廣西產(chǎn)羅漢松葉高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究的方法，可為羅漢松葉的鑒別及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)羅漢松的研究多集中在藥理作用和化學(xué)成分提取方面。陳永鈞等（2013）研究表明，羅漢松的乙醇提取物具有體外抗氧化活性。周燕等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，羅漢松種子提取物對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803有明顯的體外抑制作用，其抑制作用與藥物的質(zhì)量濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān);之后通過(guò)藥物體外試驗(yàn)，進(jìn)一步明確了羅漢松種子對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803發(fā)揮抑制作用的生物活性部位為其95%乙醇提取部位（周燕，2015）。隗磊等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的羅漢松實(shí)醇提物具有降血脂、保肝及抗氧化作用。王彬（2016）從羅漢松枝葉的95%乙醇提取物中分離鑒定出23個(gè)化合物，并發(fā)現(xiàn)二萜類化合物inumakilactone A對(duì)腫瘤細(xì)胞Hela和OS-RC-2具有較強(qiáng)的增殖抑制活性。趙凱麗和黃增瓊（2018）采用氣相色譜—質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)羅漢松種子揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅漢松種子揮發(fā)油中含有大量的川芎嗪（四甲基吡嗪），相對(duì)百分含量高達(dá)97.27%，提示川芎嗪是羅漢松種子治療心胃痛的物質(zhì)基礎(chǔ)。袁堂豐等（2019）采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到羅漢松總二萜的最佳提取工藝參數(shù)為：甲醇濃度80.00%、提取溫度63.0 ℃、液料比26∶1（mL/g），此工藝下羅漢松總二萜得率為1.13%;提取到的羅漢松總二萜對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子具有不同的清除能力，最大清除率分別為81.71%、66.27%和38.60%。【本研究切入點(diǎn)】目前有關(guān)羅漢松的質(zhì)量控制方法較少，吳魯東等（2012）對(duì)其進(jìn)行了性狀、顯微和薄層方面的鑒別，尚未見指紋圖譜的研究報(bào)道。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，基本反映中藥材或中成藥的化學(xué)成分和含量分布情況，是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量較全面的方法，目前已廣泛應(yīng)用于多種中藥的質(zhì)量控制中（丘琴等，2017;黃紅泓等，2019;陳林杰等，2020;崔譽(yù)文等，2020;童培珍等，2020）。液相色譜法具有簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、檢測(cè)器種類多等特點(diǎn)，是構(gòu)建指紋圖譜的重要方法之一。本研究以廣西不同產(chǎn)地的10批羅漢松葉為研究對(duì)象，以穗花杉雙黃酮為參照峰，建立羅漢松葉HPLC指紋圖譜，對(duì)羅漢松葉進(jìn)行質(zhì)量分析，可科學(xué)評(píng)價(jià)羅漢松葉的質(zhì)量。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立羅漢松葉HPLC指紋圖譜共有模式，使用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)10批廣西不同產(chǎn)地羅漢松葉的共有峰進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)其相似度進(jìn)行評(píng)價(jià);使用SPSS 21.0，以共有峰原始峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，以期為從整體上控制羅漢松葉的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

10批羅漢松葉藥材采自廣西不同產(chǎn)地，經(jīng)馬利飛副主任中藥師（廣西一心藥業(yè)醫(yī)藥有限責(zé)任公司）鑒定為羅漢松科羅漢松屬羅漢松（P. macrophyllus）的葉，藥材信息見表1。95%乙醇、磷酸（20120315，AR）和冰醋酸（20160108，AR）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，甲醇（色譜醇）購(gòu)自Fisher公司，穗花杉雙黃酮（批號(hào)：170109）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。主要儀器設(shè)備：Agilent-1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）;Millipore Simplicity-185超純水儀（美國(guó)密里博公司）;KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;BP211D分析天平[德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1. 2 供試品溶液制備

精密稱取羅漢松葉粉末（通過(guò)3號(hào)篩）約1 g，加95%乙醇溶液30 mL置于錐形瓶中，搖勻，稱定，80 ℃回流提取2 h，放冷，補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容? mL容量瓶中，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，制備得供試品溶液。

1. 3 對(duì)照品溶液制備

取穗花杉雙黃酮對(duì)照品，精密稱定10.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，得穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液，濃度為2 mg/mL;精密量取穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液2 mL至5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.8 mg/mL的穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液;再精密量取上述穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液0.127 mL，置于2 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，得濃度為0.0508 mg/mL的穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液。

1. 4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry? C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）;流動(dòng)相：甲醇—0.1%磷酸;檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm;流速：1 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL;洗脫程序見表2。

1. 5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，按1.4的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定分析，檢測(cè)HPLC系統(tǒng)對(duì)有效成分的分離效果。

1. 6 方法學(xué)考察

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)可知，羅漢松葉中含芹菜素和穗花杉雙黃酮，其中穗花杉雙黃酮含量較高，峰面積較大，分離度較好，峰型較高，因此選擇穗花杉雙黃酮作為參照峰。

1. 6. 1 精密度試驗(yàn) 取羅漢松葉樣品（那坡縣）約1 g，按1.2的方法制備供試品溶液，再按1.4的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，計(jì)算HPLC圖譜中各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以檢測(cè)儀器的精密度。

1. 6. 2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一份羅漢松葉樣品1 g，按1.2的方法制備供試品溶液，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)（0、2、4、8、12和24 h）按1.4的色譜條件進(jìn)樣分析，分別計(jì)算HPLC圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，以測(cè)定該樣品的穩(wěn)定性。

1. 6. 3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批羅漢松葉樣品6份，每份1 g，按1.2的方法制備供試品溶液，按1.4的色譜條件進(jìn)樣分析，分別計(jì)算HPLC圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，測(cè)定分析方法重復(fù)性。

1. 7 樣品指紋圖譜測(cè)定

精密稱取10批廣西不同產(chǎn)地的羅漢松葉粉末各1 g，按照1.2的方法制備供試品溶液，再根據(jù)1.4的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄10批不同產(chǎn)地羅漢松葉HPLC圖。將不同產(chǎn)地的10批羅漢松葉HPLC圖譜數(shù)據(jù)錄入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版），設(shè)置參比峰和時(shí)間窗后進(jìn)行自動(dòng)化匹配及相似度計(jì)算，得到各產(chǎn)地樣品測(cè)定的指紋圖譜。

1. 8 特征圖譜構(gòu)建

通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版）確定各樣品的共有特征峰，構(gòu)建各樣品的羅漢松葉高效液相特征圖譜。

1. 9 相似度評(píng)價(jià)

對(duì)10批不同產(chǎn)地羅漢松葉的指紋圖譜，使用多點(diǎn)校正法，以對(duì)照?qǐng)D譜為參照，以中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，從而對(duì)10批不同產(chǎn)地羅漢松葉的指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算。

1. 10 聚類分析

以10批羅漢松葉藥材的共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用組間連接的聚類方法，利用SPSS 21.0進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

羅漢松葉供試品的色譜圖顯示峰形良好，基線平穩(wěn)，相鄰峰之間分離良好，沒(méi)有溶劑峰及雜質(zhì)峰的出現(xiàn);穗花杉雙黃酮對(duì)照品峰形良好，出峰保留時(shí)間在52 min左右（圖1）。

2. 2 方法學(xué)考察結(jié)果

2. 2. 1 精密度試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)羅漢松葉供試品溶液檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，符合HPLC指紋圖譜的分析要求，其主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2. 2. 2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)羅漢松葉供試品溶液檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，其主要共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，表明樣品提取液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定，可用于檢測(cè)。

2. 2. 3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)羅漢松葉供試品溶液檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，以穗花杉雙黃酮（6號(hào)色譜峰）為參照峰，所有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，均符合指紋圖譜要求，表明HPLC法建立廣西產(chǎn)羅漢松葉指紋圖譜重復(fù)性良好。

2. 3 羅漢松葉指紋圖譜測(cè)定結(jié)果

以北海市樣品（S10）的指紋圖譜作為參照指紋圖譜，10批羅漢松葉樣品的色譜圖如圖2所示，共有26個(gè)共有特征峰被確定，其中22個(gè)共有峰具有特征明顯，穩(wěn)定性好，吸收峰強(qiáng)的特點(diǎn)，選其為共有峰;穗花杉雙黃酮（6號(hào)色譜峰）在各樣品色譜圖中的穩(wěn)定性較好，可作為參照峰。通過(guò)指紋圖譜可比較出10個(gè)產(chǎn)地中羅漢松葉含有的共有峰，以確定不同產(chǎn)地羅漢松葉中可能含有的相同物質(zhì)。

2. 4 特征圖譜的建立

利用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)構(gòu)建羅漢松葉提取物的特征圖譜（圖3），22個(gè)共有峰的峰面積及保留時(shí)間見表3。以穗花杉雙黃酮（6號(hào)色譜峰）作為參照峰，其保留時(shí)間和峰面積設(shè)為1.0000，計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（表4）和相對(duì)峰面積（表5），并計(jì)算10個(gè)產(chǎn)地羅漢松葉提取物非共有峰面積與總峰面積百分比（表6）。由表4和表5可知，在10批羅漢松葉藥材的指紋圖譜中，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.05%～0.96%，表明各產(chǎn)地間樣品共有峰出峰時(shí)間較穩(wěn)定;而相對(duì)峰面積的RSD為3.17%～48.13%，表明廣西不同產(chǎn)地羅漢松葉的成分含量有較大差異。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）

收稿日期：2020-04-28

基金項(xiàng)目：廣西一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2018XK052）;壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（桂教科研〔2013〕20號(hào)）;廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（桂科基字〔2014〕32號(hào)）;廣西重點(diǎn)學(xué)科壯藥學(xué)項(xiàng)目（桂教科研〔2013〕16號(hào)）

通訊作者：丘琴（1983-），https：//orcid.org/0000-0002-3908-9685，博士，教授，主要從事藥學(xué)和中藥學(xué)的教學(xué)及科研工作，E-mail：12031983@163.com

第一作者：陳明偉（1977-），https：//orcid.org/0000-0001-6952-6930，副教授，主要從事中藥活性成分及質(zhì)量控制研究工作，E-mail：262584687@ qq.com