都柳江易危魚類小口白甲魚種群遺傳多樣性的AFLP分析

安丹丹 代應(yīng)貴 韓雪

摘要：【目的】從分子水平揭示珠江水系都柳江小口白甲魚種群遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性的特點(diǎn)，探討其致危原因及機(jī)制，為開展小口白甲魚種群保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。【方法】于貴州境內(nèi)都柳江三都、興華和榕江3個采樣點(diǎn)共采集30尾小口白甲魚，篩選8個引物組合對都柳江小口白甲魚種群全基因組DNA進(jìn)行AFLP分析，采用PopGene32進(jìn)行位點(diǎn)總數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計，并計算Shannons信息指數(shù)（I）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）、多態(tài)信息含量（PIC）、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）及個體遺傳距離（DA）等遺傳參數(shù)?！窘Y(jié)果】采用8個引物組合從都柳江小口白甲魚種群中共擴(kuò)增出699條擴(kuò)增片段，片段長度為69～500 bp，平均每個引物組合擴(kuò)增獲得87.38個位點(diǎn)。在699個擴(kuò)增位點(diǎn)中，有663個位點(diǎn)為多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的94.85%。699個擴(kuò)增位點(diǎn)在30尾都柳江小口白甲魚個體中的出現(xiàn)頻率可劃分為10個區(qū)間，其中，頻率區(qū)間30%～89%的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)差異不明顯，而頻率區(qū)間0～9%和90%～99%的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)出現(xiàn)峰值。都柳江小口白甲魚種群的I、H、PIC、Na、Ne平均值分別為0.3490、0.2206、0.6404、1.9464和1.3574，個體間的DA為0.2305～0.4440，平均為0.3304;基于DA構(gòu)建的都柳江小口白甲魚種群UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，30尾都柳江小口白甲魚聚成兩大分支，即個體18單獨(dú)聚為一個分支，而其余29尾都柳江小口白甲魚個體聚為另一分支?！窘Y(jié)論】都柳江小口白甲魚種群遺傳多樣性豐富，但存在有效種群規(guī)模變小及有效等位基因丟失的現(xiàn)象，推測其為生態(tài)瀕危物種，應(yīng)采取相關(guān)措施對都柳江小口白甲魚種群進(jìn)行科學(xué)保護(hù)。

關(guān)鍵詞： 小口白甲魚;群體遺傳多樣性;AFLP分析;多態(tài)位點(diǎn);都柳江

中圖分類號： S965.199 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2294-08

AFLP analysis of genetic diversity in population of vulnerable species Onychostoma lini from Duliu River

AN Dan-dan1， DAI Ying-gui1，2*， HAN Xue1

（1College of Animal Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2Special Fisheries

Research Institute， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract：【Objective】To clarify the genetic structure and diversity of Onychostoma lini population from the Duliu River in the Pearl River system， and explore the endangered mechanism， and provide reference for protection countermeasures of the species. 【Method】The genetic diversity of whole genome DNA in the 30 individuals of O. lini collected in the river in Sandu， Xinghua and Rongjiang of Guizhou was analyzed by the methods of AFLP using 8 selected primer pairs， the parameters for genetic diversity including total number of amplified locus， number of amplified polymorphic locus， Shannons information index（I）， Neis gene diversity index（H）， polymorphism information content（PIC）， number of observed allele（Na）， number of effective allele （Ne） and genetic distance（DA） were calculated by PopGene32. 【Result】A total of 699 amplification fragments comprising 69-500 bp respectively were amplified using the 8 primer pairs. On average， 87.38 sites were obtained for each primer combination amplification. Among the 699 amplification sites， ?663 were polymorphic loci accounting for 94.85% of the total. The 699 amplified loci were distributed in 10 intervals of occurrence frequency of locus in the 30 individuals of O. lini from the Duliu River. Of them， the number of amplified locus changed slightly in interval of occurrence frequency of 30%-89% but those in intervals of occurrence frequency of 0%-9% and 90%-99% both occurred peak values. The values of I， H， PIC， Na and Ne in the population averaged ? 0.3490， 0.2206， 0.6404， 1.9464 and 1.3574， respectively. The DA of the 30 individuals ranged from 0.2305 to 0.4440， with an average of 0.3304. The UPGMA phylogenetic tree of the population based on DA ?showed that， ?the 30 individuals was clustered into 2 branches based on the genetic distance， 18 individuals was clustered into a branch and the rest 29 into another. 【Conclusion】The population of O. lini from the Duliu River contained high genetic diversity， but the effective population size had become small and some effective alleles had been lost in the population， and therefore O. lini might be an ecologically endangered species. It is necessary to take measures to protect the O. lini population in the Duliu River.

Key words： Onychostoma lini; population genetic diversity; AFLP analysis; polymorphic site; Duliu River

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（30760189，30960297）; Scientific and Technological Project of Guizhou（QiankeheJ〔2007〕2062）

0 引言

【研究意義】小口白甲魚（Onychostoma lini）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲃亞科（Barbinae）白甲魚屬（Onychostoma），主要分布在我國沅江水系、汀江、九龍江及珠江下游水系，為淡水名優(yōu)野生經(jīng)濟(jì)魚類（代應(yīng)貴等，2010）。近年來，受人類活動的影響，小口白甲魚野生資源瀕臨枯竭，已被列為易危魚類（汪松和解焱，2004）。在貴州境內(nèi)，小口白甲魚僅殘存分布于長江水系清水江和珠江水系都柳江部分河段（代應(yīng)貴和陳毅峰，2007），其種群數(shù)量非常稀少。遺傳多樣性是指種內(nèi)不同群體或同一群體內(nèi)不同個體遺傳變異的總和，是生物多樣性的基礎(chǔ)（陳靈芝，1993）。種群遺傳多樣性是評價物種在自然壓力下生存能力的重要指標(biāo)（Erickson et al.，2004）。在物種適應(yīng)生存環(huán)境變化的過程中，低水平的遺傳多樣性常伴隨著雜合度降低和近交衰退，進(jìn)而制約種群對環(huán)境變化的適應(yīng)能力和進(jìn)化潛力，增加種群滅絕的風(fēng)險（Erickson er al.，2004;佟廣香等，2009;施雯等，2010）。開展生物種群遺傳多樣性研究不僅可揭示物種進(jìn)化的歷史，還能為進(jìn)一步分析其進(jìn)化潛力和未來命運(yùn)提供證據(jù)，尤其有助于對物種稀有或瀕危原因及其過程進(jìn)行探討（陳珊珊和周明芹，2010）。因此，檢測和評估受威脅魚類種群遺傳多樣性，可分析其自然生境適應(yīng)能力并揭示致危原因和機(jī)制，進(jìn)而提出科學(xué)的保護(hù)策略?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）是荷蘭科學(xué)家于1995年提出研究群體遺傳變異的成熟分子標(biāo)記技術(shù)，具有所需DNA量少、可重復(fù)性好、多態(tài)性檢測靈敏及無需了解其遺傳背景等優(yōu)點(diǎn)（李秀詩等，2019;廖秋石等，2020）。該技術(shù)是基于限制性酶切和PCR的全基因組DNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性檢測方法，克服了限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）復(fù)雜和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，但保留了RFLP重復(fù)性高及PCR簡便快捷等優(yōu)點(diǎn)（馬召騰和潘連德，2011）。韓志強(qiáng)等（2007）采用AFLP、RAPD及Cytb基因序列分析等3種方法研究半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）群體的遺傳變異，結(jié)果表明AFLP分子標(biāo)記對群體遺傳變異的檢測較其他2種方法更靈敏。近年來，AFLP分子標(biāo)記更多應(yīng)用于水產(chǎn)動物群體遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性分析（Sharifi et al.，2015;孫苗苗等，2017;Napora-Rutkowski et al.，2017;劉良國等，2018）。陳見等（2014）采用AFLP分子標(biāo)記對翹嘴鲌（Erythroculter ilishaeformis，♀）、黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda，♂）及其雜種F1群體進(jìn)行遺傳差異分析;Sharifi等（2015）采用AFLP分子標(biāo)記研究波斯灣對阿巴斯、布什爾和阿巴丹近岸海域烏鲹（Parastromateus niger）3個群體的親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化，結(jié)果表明這3個波斯灣烏鲹群體分屬不同種群;劉祥芳等（2017）基于AFLP技術(shù)在太湖野生翹嘴鲌群體中篩選出雌、雄性個體的特異分子標(biāo)記，并進(jìn)行性別連鎖基因及其轉(zhuǎn)換標(biāo)記研究;閆學(xué)春等（2018）利用AFLP分子標(biāo)記證實外源基因組DNA可通過顯微注射方式整合到鯽（Carassius auratus）的基因組中，從而獲得轉(zhuǎn)基因鯽?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】小口白甲魚為我國特有魚類和重要經(jīng)濟(jì)魚類，但該物種正面臨著種群數(shù)量減少和分布區(qū)急劇縮小的趨勢，且有關(guān)小口白甲魚分子標(biāo)記或多態(tài)性的研究報道極少，僅見代應(yīng)貴等（2010）采用DNA測序技術(shù)對都柳江小口白甲魚種群進(jìn)行mtDNA D環(huán)序列變異及遺傳多樣性分析。因此，從不同角度對都柳江小口白甲魚種群的遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)評估，進(jìn)而開展其野生種群的恢復(fù)與保護(hù)顯得十分迫切?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記基于全基因組進(jìn)行珠江水系都柳江小口白甲魚種群遺傳變異分析，從分子水平揭示其種群遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性的特點(diǎn)，探討小口白甲魚致危原因及機(jī)制，為開展小口白甲魚種群保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集及全基因組DNA提取

供試都柳江小口白甲魚以刺網(wǎng)采自貴州境內(nèi)都柳江三都至榕江河段（圖1），在三都、興華和榕江3個采樣點(diǎn)分別采集5、10和15尾，共計30尾。都柳江小口白甲魚捕獲后解剖取其肌肉樣品，并以乙醇保存?zhèn)溆谩＜∪鈽悠凡捎煤Ｑ髣游锝M織基因組DNA提取試劑盒[DP324-02，天根生化科技（北京）有限公司]進(jìn)行全基因組DNA提取。

1. 2 AFLP分析

AFLP分析所用的接頭和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，限制性內(nèi)切酶EcoR I（B300140-0005）/Mse I（B300224-0300）、T4 DNA連接酶（B600511-0002）、dNTP（B300576-0200）、Taq DNA聚合酶（B600001-0200）及10×Buffer（B300048-0005）也購自生工生物工程（上海）股份有限公司。經(jīng)預(yù)試驗篩選出8個引物組合（表1）對都柳江小口白甲魚種群全基因組DNA進(jìn)行AFLP分析。

1. 2. 1 限制性酶切與連接反應(yīng) ?酶切反應(yīng)體系20.0 μL：DNA模板4.0 μL，Adapter 1.0 μL，EcoR I/Mse I 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，T4 DNA連接酶1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，混勻后離心數(shù)秒。酶切程序：37 ℃ 5 h，8 ℃ 4 h，4 ℃過夜。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。

1. 2. 2 預(yù)擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系25.0 μL：DNA模板 2.0 μL，PreAmp Mix（預(yù)擴(kuò)引物）1.0 μL，dNTPs 1.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 18.0 μL，混勻后離心數(shù)秒。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1. 2. 3 選擇性擴(kuò)增 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物按1∶20稀釋后作為擴(kuò)增模板。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋樣品2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，EcoR I/Mse I各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，混勻后離心數(shù)秒。擴(kuò)增程序：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s;再進(jìn)行12個循環(huán)，每個循環(huán)的退火溫度遞減0.7 ℃;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，進(jìn)行23個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 電泳 采用貝克曼庫爾特公司的CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)，運(yùn)用熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管中進(jìn)行電泳分離，以激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，電泳結(jié)果通過CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)自帶軟件自動統(tǒng)計分析并轉(zhuǎn)換成“0，1”矩陣，保存于Excel表格供數(shù)據(jù)處理。

1. 3 數(shù)據(jù)處理

采用PopGene32進(jìn)行位點(diǎn)總數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計，計算Shannons信息指數(shù)（I）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）、觀測等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）等遺傳參數(shù)。根據(jù)公式PIC=∑（1-Pi2）/n計算多態(tài)信息含量（PIC），其中Pi為任一引物組合擴(kuò)增獲得第i條條帶在所有供試材料中出現(xiàn)的頻率;參照Nei等（1983）的方法計算個體間的遺傳距離（DA），并基于DA采用MEGA 6.0構(gòu)建都柳江小口白甲魚種群UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 都柳江小口白甲魚種群AFLP擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)預(yù)試驗篩選，選擇8個引物組合（表1）對都柳江小口白甲魚基因組進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得多態(tài)性豐富、成像清晰而穩(wěn)定的電泳條帶，即AFLP擴(kuò)增圖譜（圖2）。

采用8個引物組合對都柳江小口白甲魚種群（30尾）基因組進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得699條擴(kuò)增片段，片段長度為69～500 bp（表2）。每個引物組合擴(kuò)增獲得的片段數(shù)在54～121條，平均為87.38條。以引物組合8得到的擴(kuò)增片段數(shù)最少（54條），而引物組合2得到的擴(kuò)增片段數(shù)最多（121條）。每個引物組合擴(kuò)增獲得的基因型數(shù)在29～30個，平均為29.50個。

2. 2 都柳江小口白甲魚種群遺傳多樣性分析結(jié)果

在都柳江小口白甲魚種群中，8個引物組合共擴(kuò)增出699個位點(diǎn)，平均為87.38個位點(diǎn)（表3）。在699個擴(kuò)增位點(diǎn)中，有663個位點(diǎn)為多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的94.85%。8個引物組合的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)在50～111個，多態(tài)位點(diǎn)比例為86.30%～98.91%，平均為94.64%。以引物組合5擴(kuò)增獲得的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最多（111個），而引物組合8擴(kuò)增獲得的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最少（50個）;引物組合4擴(kuò)增獲得的多態(tài)位點(diǎn)比例最高（98.91%），而引物組合2擴(kuò)增獲得的多態(tài)位點(diǎn)比例最低（86.30%）。8個引物組合擴(kuò)增的共有位點(diǎn)數(shù)為1～10個，平均為4.50個。都柳江小口白甲魚種群的I、H、PIC、Na、Ne平均值分別為0.3490、0.2206、0.6404、1.9464和1.3574（表3）。

699個擴(kuò)增位點(diǎn)在30尾都柳江小口白甲魚個體中的出現(xiàn)頻率可劃分為10個區(qū)間：0～9%、10%～19%、20%～29%、30%～39%、40%～49%、50%～59%、60%～69%、70%～79%、80%～89%、90%～99%和位點(diǎn)頻率為100%的關(guān)鍵點(diǎn)（圖3）。其中，頻率區(qū)間30%～89%的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)差異不明顯，而頻率區(qū)間0～9%和90%～99%的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)出現(xiàn)峰值。

2. 3 都柳江小口白甲魚種群的聚類分析結(jié)果

30尾都柳江小口白甲魚個體間的DA為0.2305～0.4440，平均為0.3304。基于DA構(gòu)建的都柳江小口白甲魚種群UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）顯示，30尾都柳江小口白甲魚聚成兩大分支。其中，個體18單獨(dú)聚為一個分支，而其余29尾都柳江小口白甲魚聚為另一分支。

3 討論

遺傳多樣性可反映種內(nèi)遺傳變異水平，是衡量種群生存、進(jìn)化及其對環(huán)境條件適應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)（陳靈芝，1993）。豐富的遺傳多樣性決定了物種的進(jìn)化潛力及適應(yīng)環(huán)境變化的能力，有助于保持物種和整個生態(tài)系統(tǒng)的多樣性（陳珊珊和周明芹，2010）。多態(tài)位點(diǎn)比例是評價群體遺傳多樣性的特征參數(shù)（佟廣香等，2009）。若群體中同一引物組合擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的比例超過50%，即認(rèn)為該群體具有較豐富的遺傳多樣性（陳良華等，2009）。本研究以篩選出的8個引物組合對都柳江小口白甲魚種群進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，獲得的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的86.3%～98.91%，平均為94.64%，顯著高于長江合江江段的巖原鯉（Procypris rabaudi）群體（37.50%～68.57%）（宋君等，2005）和黑龍江水系呼瑪河的野生哲羅魚群體（43.64%～55.64%）（佟廣香等，2009），也高于洞庭湖庫區(qū)（85.41%）和沅水下游（83.25%）的黃顙魚（Pelteobagrus nitidus）群體（劉良國等，2018），表明都柳江小口白甲魚種群具有較豐富的遺傳變異。I 和H是反映群體遺傳變異的常用指標(biāo)，其數(shù)值越高則表明遺傳變異越大，群體遺傳多樣性越高（佟廣香等，2009）。本研究中，都柳江小口白甲魚種群的I為0.2862～0.3969（平均為0.3490），H為0.1713～0.2585（平均為0.2206），分別高于黑龍江水系呼瑪河哲羅魚群體（I=0.2215，H=0.1480）（佟廣香等，2009）、烏蘇里江尖吻細(xì)鱗鮭（Brachymystax lenok）群體（I=0.1985，H=0.1364）（王荻等，2010）及鰱（Hypophthalmichthys molitrix）長江水系邗江群體、老河群體、珠江群體和黑龍江群體（I=0.0784～0.1051，H=0.0481～0.0661）（嚴(yán)駿驄等，2010）等，進(jìn)一步說明都柳江小口白甲魚種群具有較高的遺傳多樣性。當(dāng)PIC≥0.50時擴(kuò)增位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)，0.25

Na與Ne間的差異越小，表明該等位基因在群體內(nèi)分布的均勻度越高（戴習(xí)林等，2017）。都柳江小口白甲魚種群的Na在1.8630～1.9891，平均為1.9464;Ne在1.2645～1.4326，平均為1.3574，即Na明顯高于Ne，表明該種群中等位基因分布的均勻度較低，存在有效種群規(guī)模變小且有效等位基因丟失的現(xiàn)象。都柳江蘊(yùn)藏著豐富的水力資源，其干流自三都以下河段現(xiàn)已規(guī)劃17級航電開發(fā)樞紐（曹孟智，2016），其中在榕江縣、三都縣境內(nèi)分別修建的永福電站（趙景志等，2016）和白梓橋電站已實現(xiàn)截流發(fā)電，水電站大壩的修建對壩址上下游河段產(chǎn)生了阻隔效應(yīng)，導(dǎo)致其水域生境片段化，阻斷了小口白甲魚的洄游路徑。這可能是導(dǎo)致都柳江小口白甲魚有效種群規(guī)模變小、有效等位基因丟失的主要原因。瀕危物種、狹窄物種和特有物種的種群普遍處于較低的遺傳多樣性水平（Ellstrand and Elam，1993）。小口白甲魚已被列為易危物種（汪松和解焱，2004），但本研究結(jié)果表明都柳江小口白甲魚種群仍保存著較豐富的遺傳多樣性，故推測都柳江小口白甲魚屬于生態(tài)瀕危物種，因此建議采取有針對性的對策積極開展其種群資源保護(hù)：（1）保護(hù)都柳江河流生境，對河流沿岸村莊、集鎮(zhèn)、縣城進(jìn)行垃圾無害化處理和污水處理，防止對都柳江造成水質(zhì)污染，以滿足小口白甲魚對棲息水域水質(zhì)的要求;（2）在都柳江開展水利工程建設(shè)時須進(jìn)行環(huán)評論證，確保不會對小口白甲魚種群造成負(fù)面影響，如建設(shè)水電站大壩時應(yīng)修建過魚通道等配套工程以免阻斷小口白甲魚的洄游路徑;（3）加大對都柳江小口白甲魚種群的保護(hù)力度，實行禁漁期、禁漁區(qū)制度，嚴(yán)格執(zhí)法，最大限度地減小人為捕撈的影響;（4）對野生小口白甲魚進(jìn)行人工馴養(yǎng)繁殖試驗，積極開展小口白甲魚人工增殖放流;（5）開展都柳江小口白甲魚種群動態(tài)監(jiān)測及保護(hù)生物學(xué)研究。

進(jìn)行群體遺傳學(xué)評價時，樣本充分采集是準(zhǔn)確評估群體遺傳結(jié)構(gòu)的前提條件，檢測樣本量及分子標(biāo)記的選用直接影響遺傳評估效率（戴習(xí)林等，2017）。在珍稀瀕危魚類種群遺傳學(xué)研究中，常因種群數(shù)量稀少而無法采集到較大數(shù)量的試驗樣本。Sj?gren和Wy?ni（1994）通過計算機(jī)模擬運(yùn)算發(fā)現(xiàn)，樣本量和等位基因位點(diǎn)數(shù)過少會導(dǎo)致檢測群體遺傳變異偏低，甚至檢測不到變異。李思發(fā)（1998）應(yīng)用同工酶技術(shù)進(jìn)行淡水魚類種質(zhì)資源研究時發(fā)現(xiàn)，供試群體樣本量應(yīng)大于30尾。張繼全等（1998a，1998b）基于計算機(jī)模擬和中國黃牛（Bos taurus）品種實例分析，認(rèn)為基因位點(diǎn)數(shù)和樣本量是影響群體遺傳距離估測精度的主要因素。劉麗等（2005）通過對40尾勒氏笛鯛（Lutjanus russellii）的DNA進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)調(diào)查樣本量應(yīng)達(dá)20尾且位點(diǎn)數(shù)應(yīng)達(dá)70個才能保證研究結(jié)果的可靠性。戴習(xí)林等（2017）對羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）種群的SSR分析也顯示樣本量及分子標(biāo)記量對種群遺傳多樣性指標(biāo)有顯著影響，而性別對群體遺傳多樣性指標(biāo)無顯著性影響，當(dāng)樣本量大于30尾、分子標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)大于25個時，群體各遺傳參數(shù)值趨于穩(wěn)定。

AFLP是一種成熟的種群遺傳多樣性檢測方法，其技術(shù)要求用于群體遺傳多樣性分析的樣本量要足夠多，然而在實際操作中受研究規(guī)模、經(jīng)費(fèi)和時間限制、可供分析基因位點(diǎn)的豐富性及標(biāo)本樣品可獲得性等因素的影響，常導(dǎo)致用于研究的群體樣本量只能維持在一定水平。周藝彪等（2005）對湖北釘螺（Oncomelania hupensis）種群遺傳多樣性的AFLP分析結(jié)果表明，當(dāng)試驗樣本量超過30只、基因位點(diǎn)總數(shù)超過338個時，其種群遺傳多樣性指標(biāo)值趨于穩(wěn)定。由于水域生境破壞及人為過度捕撈的影響，小口白甲魚在都柳江目前僅殘存分布于三都至榕江江段，種群數(shù)量極少。本研究在三都至榕江河段不同采集點(diǎn)共計采集30尾小口白甲魚，通過AFLP技術(shù)標(biāo)記出669個基因位點(diǎn)，其研究結(jié)果能反映該種群遺傳多樣性水平的現(xiàn)狀，具有較高的可信度。由于群體遺傳多樣性的準(zhǔn)確測定受樣本量、擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)及分子標(biāo)記等多種因素的影響（周藝彪等，2005;戴習(xí)林等，2017），因此今后可通過增加樣本量、擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)及采用其他分子標(biāo)記對都柳江小口白甲魚種群遺傳多樣性進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié)論

都柳江小口白甲魚種群遺傳多樣性豐富，但存在有效種群規(guī)模變小及有效等位基因丟失的現(xiàn)象，推測其為生態(tài)瀕危物種，應(yīng)采取相關(guān)措施對都柳江小口白甲魚種群進(jìn)行科學(xué)保護(hù)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2020-07-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（30760189，30960297）;貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目（黔科合J字〔2007〕2062）

通訊作者：代應(yīng)貴（1968-），https：//orcid.org/0000-0001-6104-7671，教授，主要從事水產(chǎn)生物種質(zhì)資源研究工作，E-mail：daiygui@163.com

第一作者：安丹丹（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-2674-0889，研究方向為水產(chǎn)動物種質(zhì)資源學(xué)，E-mail：2479277157@qq.com