高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定喉康散中靛藍(lán)和靛玉紅含量

李 玲，王婷婷，陳乃江

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222006）

喉康散處方來源于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第五冊(cè)）》，由冰片、硼砂、青黛、玄明粉、珍珠層粉等10 味中藥組方，用于治療急、慢性咽炎，喉炎，扁桃體炎，口腔潰瘍等咽喉疾?。?］。方中，青黛味咸，性寒，具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚等功效，主要活性成分為脂溶性成分靛藍(lán)和靛玉紅［2－5］。由于市售的青黛藥材質(zhì)量差異大，造假嚴(yán)重，偽劣品較多［6］?，F(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅采用薄層色譜法對(duì)靛藍(lán)和靛玉紅進(jìn)行定性鑒別，缺乏對(duì)制劑中有效成分的含量測(cè)定［1］。本研究中建立了同時(shí)測(cè)定喉康散中靛藍(lán)和靛玉紅含量的高效液相色譜法，以改進(jìn)現(xiàn)有質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，確保產(chǎn)品質(zhì)量可控?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司），配有Waters 2998 光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器，Empower 色譜工作站；Sartorius BP211D 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；KH－700DE 型數(shù)控超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為700 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

靛藍(lán)對(duì)照品（批號(hào)為 110716－201612，純度為98.7%），靛玉紅對(duì)照品（批號(hào)為 110717 －201805，純度為99.6%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；喉康散（市售，桂林葛仙翁藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為180407，181217，190112）；N，N －二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 － 0.05 moL ／L 醋酸銨溶液（75 ∶25，V ／ V）；流速：1.0 mL ／ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：289 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。取陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，理論板數(shù)按靛藍(lán)和靛玉紅峰計(jì)均不低于3 000，拖尾因子均不超過1.5。色譜圖見圖1?？梢?，靛藍(lán)與靛玉紅及相鄰色譜峰均能完全分離，且陰性對(duì)照無干擾。

圖1 高效液相色譜圖1.indigotin 2.indirubinA.Mixed reference solution B.Test solution C. Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

取靛玉紅對(duì)照品21.44 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加DMF 適量，超聲（功率為700 W，頻率為40 kHz）使溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為靛玉紅對(duì)照品貯備液。取靛藍(lán)對(duì)照品28.32 mg，精密稱定，置 200 mL 容量瓶中，加 DMF 適量，超聲使溶解，精密量取靛玉紅對(duì)照品貯備液10 mL，置同一200 mL 容量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。精密量取混合對(duì)照品貯備液5 mL，置25 mL 容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得靛藍(lán)和靛玉紅質(zhì)量濃度分別為28.32 μg ／mL 和 2.144 μg ／mL 的混合對(duì)照品溶液。取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入DMF 50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用DMF 補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備不含青黛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液 1，2，4，5，6，8，10 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，加DMF 稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。取上述溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y藍(lán)＝5.785 6 ×104X藍(lán)－5.048 8 ×104，r ＝0.999 9（ n ＝ 7）；Y紅＝ 6.365 7 × 104X紅－ 6.391 × 103，r ＝ 0.999 2（n ＝7）。結(jié)果表明，靛藍(lán)與靛玉紅質(zhì)量濃度分別在5.664 ～56.640 μg／mL 和 0.428 8 ～ 4.288 0 μg ／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的 RSD 分別為 0.35% 和 0.68% （n ＝ 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為181217）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，依法計(jì)算含量。結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅含量的 RSD 分別為 0.78% 和 1.14% （n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為181217）樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，8，12，18，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的 RSD 分別為 1.12% 和 1.86% （n ＝ 7），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批（批號(hào)為181217）樣品 0.25 g，精密稱定，共 6 份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液5 mL，依法制備供試品溶液。按2.1 項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定靛藍(lán)和靛玉紅的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝ 6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取 3 批（批號(hào)分別為 180407，181217，190112）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量。結(jié)果3 批樣品中靛藍(lán)的含量分別為 2.81，2.78，2.89 mg ／g，靛玉紅的含量分別為 0.225，0.217，0.232 mg ／g。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

采用高效液相色譜法測(cè)定靛藍(lán)和靛玉紅的含量，以待測(cè)色譜峰的峰形和與其他色譜峰的分離度作為考察指標(biāo)，曾考察不同流動(dòng)相（甲醇－水、乙腈－水、甲醇－醋酸銨體系、乙腈－醋酸銨體系、甲醇－磷酸鹽緩沖液、乙腈 －磷酸鹽緩沖液），發(fā)現(xiàn)以甲醇 － 0.05 moL ／L 醋酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，可滿足靛藍(lán)與靛玉紅的分離要求，且峰形好、柱效高。

3.2 樣品前處理過程選擇

靛藍(lán)和靛玉紅均為脂溶性成分，分別比較了甲醇、乙醇、三氯甲烷、DMF 及乙酸乙酯對(duì)樣品的提取效果。結(jié)果表明，DMF 提取效率最好，最終確定以DMF 作為提取溶劑。曾考察提取方法，比較了超聲提取法和回流提取法及在不同超聲時(shí)間時(shí)對(duì)樣品的提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲提取法易于操作，簡(jiǎn)便快捷，提取效果好。故最終確定以超聲提取30 min 作為提取條件。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

通過PDA 進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，測(cè)得靛藍(lán)于285 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，靛玉紅于289 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，由于樣品中靛藍(lán)與靛玉紅含量相差較大，靛玉紅的峰面積遠(yuǎn)小于靛藍(lán)的峰面積。故選擇靛玉紅的最大吸收波長(zhǎng)289 nm 作為2 種成分的共同檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果分析

2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》中規(guī)定青黛藥材中靛藍(lán)含量不得少于2.0%，靛玉紅含量不得少于0.13%。按照喉康散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］，方中青黛藥材占比為10.42%，按處方比例，計(jì)算制劑中靛藍(lán)的理論含量應(yīng)不低于 0.208% （即 2.08 mg ／g），靛玉紅的含量應(yīng)不低于0.013 5% （即 0.135 mg ／g）。結(jié)果表明，同一生產(chǎn)企業(yè)不同批號(hào)樣品中靛藍(lán)與靛玉紅的含量基本一致，且含量均符合藥典要求。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好，可用于同時(shí)測(cè)定喉康散中靛藍(lán)和靛玉紅的含量。