益氣活血類中藥對精索靜脈曲張動物模型生精細(xì)胞凋亡干預(yù)作用實驗研究的Meta分析*

蔣 越，蒙帥杰，買鵬宇，陳 露，鄭翼馳，陳 六，王權(quán)勝

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530001）

精索靜脈曲張（varicocele，VC）是男科臨床常見疾病之一，多見于青壯年男性，因其相關(guān)的陰囊疼痛不適、不育與睪丸萎縮等，尤其是對生育的影響，受到廣泛關(guān)注。VC具體指精索內(nèi)蔓狀靜脈叢出現(xiàn)異常擴(kuò)張、伸長和迂曲的微血管病變，可導(dǎo)致陰囊持續(xù)墜脹疼痛及進(jìn)行性睪丸功能減退，為男性不育癥的常見原因之一[1-3]。目前，治療VC導(dǎo)致不育癥的措施不僅僅是手術(shù)，還包括藥物和輔助生殖技術(shù)，而且3種治療方法還可以彼此協(xié)同[4]。研究表明[5-6]，VC可導(dǎo)致睪丸內(nèi)生精細(xì)胞凋亡，增加生精細(xì)胞凋亡異常，出現(xiàn)局部微循環(huán)障礙。中醫(yī)藥多采取益氣活血立法并取得了較好的療效，但對其具體療效機(jī)制尚未完全闡述清楚。動物實驗系統(tǒng)評價被認(rèn)為在一定程度上提高了動物實驗對臨床研究的指導(dǎo)水平，且有助于減少其結(jié)果向臨床轉(zhuǎn)化時的風(fēng)險[7]。為進(jìn)一步明確中醫(yī)藥治療VC的研究機(jī)制，本研究以益氣活血類中藥為案例，采用Meta分析方法對益氣活血類中藥干預(yù)實驗性VC動物模型生精細(xì)胞凋亡進(jìn)行探討，以期進(jìn)一步驗證益氣活血類中藥治療VC機(jī)制的確切性，為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 檢索策略計算機(jī)檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、重慶維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫（VIP）、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺（WFPD）、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（CBM），分別以精索靜脈曲張、筋疝、筋瘤、不育、中醫(yī)、中藥、中醫(yī)藥、中藥復(fù)方、益氣活血、中西醫(yī)結(jié)合、湯藥、草藥、左腎靜脈縮窄術(shù)、動物模型等為關(guān)鍵詞或主題詞檢索以上中文數(shù)據(jù)庫。以Varicocele、Varicocele infertility、Experimental Varicocele、Chinese Traditional Medicine、Traditional Chinese Medicine、Herbs、Medicinal herbs、Supplement qi and activate blood、Left renal vein ligation、Animal model等為檢索詞，英文數(shù)據(jù)庫檢索PubMed、Embase和Cochrane Library等。所有檢索運(yùn)用MeSH主題詞、自由詞與布爾邏輯運(yùn)算連接詞相結(jié)合的方式，采取組配、后綴、截詞等限定檢索功能，并反復(fù)完善預(yù)檢索，以確定檢索表達(dá)式，對不同數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。檢索時限均為從建庫至2019年10月1日。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 研究對象 實驗性精索靜脈曲張動物（大鼠、小鼠）模型，不局限于動物模型的構(gòu)建模式，設(shè)計類型為隨機(jī)對照實驗。

1.2.2 干預(yù)措施 中藥組給予益氣活血類中藥干預(yù)，不限于益氣活血類中藥給藥方式與劑型；模型組采用造模成功后等量對照溶液。所有動物均無聯(lián)合用藥，且整體實驗初始時間、實驗周期不限。

1.2.3 觀察指標(biāo)（1）精子密度；（2）精子活率；（3）精子活力；（4）B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）；（5）凋亡因子（Fas）；（6）凋亡因子配體（FasL）；（7）凋亡指數(shù)（AI）；(8)Johnson評分。

1.2.4 語種限制 中文及英文。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）臨床研究及綜述類文獻(xiàn)；（2）離體實驗研究；（3）實驗數(shù)據(jù)從文中無法提取或?qū)嶒灲Y(jié)果由于采用圖示而無法獲取其具體數(shù)據(jù)，且聯(lián)系原作者未能全面提供數(shù)據(jù)信息，無法開展整理分析的文獻(xiàn)研究；（4）干預(yù)措施中出現(xiàn)非益氣活血類中藥治療，如西藥、針灸等；（5）重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)，根據(jù)文獻(xiàn)信息保留至少1篇研究納入Meta分析；（6）文獻(xiàn)中精索靜脈曲張模型合并其他基礎(chǔ)疾??；（7）實驗分組中無對照組的實驗研究；（8）會議論文及摘要。

1.4 文獻(xiàn)提取由2名具備實驗研究專業(yè)基礎(chǔ)知識的研究評價員進(jìn)行獨(dú)立資料提取，包括論文第一作者、發(fā)表時間、動物種類品系、性別、樣本量、造模方法、藥物劑量、干預(yù)措施及相關(guān)結(jié)局指標(biāo)等，并進(jìn)行交叉核對。

1.5 風(fēng)險評估雖然目前尚未有動物實驗注冊中心或訪問查詢研究計劃書公開發(fā)表數(shù)據(jù)庫，但SYRCLE動物實驗偏倚風(fēng)險評估工具仍然將選擇性結(jié)果報告作為其條目之一，且其涵義與Cochrane偏倚風(fēng)險評估工具內(nèi)容相符[8]。本研究采用SYRCLE動物實驗偏倚風(fēng)險評估工具推薦的6大類偏倚類型共10個細(xì)則進(jìn)行評估：選擇性偏倚（序列產(chǎn)生、基線特征、分配隱藏）；實施偏倚（動物安置隨機(jī)化、盲法）；測量偏倚（隨機(jī)性結(jié)果評估、盲法）；失訪偏倚（不完整數(shù)據(jù)報告）；報告偏倚（選擇性結(jié)果報告）；其他偏倚（其他偏倚來源）。評估結(jié)果中低風(fēng)險偏倚、高風(fēng)險偏倚和不確定風(fēng)險偏倚分別以“是”“否”與“不確定”代表[9]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用Cochrane協(xié)作網(wǎng)的RevMan 5.3軟件進(jìn)行Meta分析。計量資料以標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（SMD）或均數(shù)差（MD）作為合并效應(yīng)量，各效應(yīng)量均采用95%可信區(qū)間（CI）表示。運(yùn)用χ2檢驗分析各實驗研究之間的異質(zhì)性，若P＞0.10且I2＜50%時，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析；若P≤0.10和/或I2≥50%時，應(yīng)先分析異質(zhì)性產(chǎn)生的原因，并采用亞組分析或敏感性分析等方式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，若仍無法消除異質(zhì)性資料，可謹(jǐn)慎使用能進(jìn)行合并分析的隨機(jī)效應(yīng)模型。Meta分析的檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。最后，繪制漏斗圖對納入文獻(xiàn)的偏倚程度進(jìn)行評價分析。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)篩選結(jié)果共檢索出中文文獻(xiàn)853篇，英文文獻(xiàn)238篇，共1 091篇。剔除重復(fù)文獻(xiàn)432篇，閱讀文題及摘要篩除臨床研究、綜述、離體實驗研究文獻(xiàn)共521篇，閱讀全文剔除干預(yù)措施中出現(xiàn)非益氣活血類中藥治療、無對照組實驗、合并其他基礎(chǔ)疾病、實驗研究指標(biāo)及數(shù)據(jù)不明確、會議論文、同一文獻(xiàn)重復(fù)發(fā)表共123篇，最終納入文獻(xiàn)15篇[10-24]，所有研究均在中國進(jìn)行，均以中文形式發(fā)表。具體文獻(xiàn)篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

2.2 文獻(xiàn)基本特征納入的所有研究為隨機(jī)對照實驗，且均在建模成功后給藥，共15篇[10-24]。10項研究[10,13,16,18-24]采用SD大鼠建立VC動物模型，5項研究[11-12,14-15,17]采用Wistar大鼠建立VC動物模型。所有研究造模方式均結(jié)扎部分左腎靜脈，觀察療程為1~3個月，結(jié)局指標(biāo)有精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2、Fas、FasL、AI、Johnson評分。所有納入研究的文獻(xiàn)基本特征詳見表1。

表1 15篇益氣活血類中藥對精索靜脈曲張動物模型生精細(xì)胞凋亡干預(yù)作用實驗研究文獻(xiàn)基本特征

2.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評價15項研究中僅有7篇文獻(xiàn)均采用隨機(jī)數(shù)字表法，其余實驗研究中動物是否被隨機(jī)分配存在著不確定因素。經(jīng)篩查所有研究后得知，針對動物基線特征、動物研究計劃書報告及益氣活血類中藥干預(yù)后模型評估報告充分，但在分配隱藏、盲法研究等內(nèi)容報告不充分，且無法判定存在其他偏倚，故不足以明確其潛在偏倚風(fēng)險，具體見表2。

表2 15篇益氣活血類中藥對精索靜脈曲張動物模型生精細(xì)胞凋亡干預(yù)作用實驗研究文獻(xiàn)文獻(xiàn)質(zhì)量評價結(jié)果

2.4 Meta分析結(jié)果為系統(tǒng)比較不同劑量下益氣活血類中藥對VC動物模型結(jié)局指標(biāo)的干預(yù)作用，根據(jù)納入的15篇文獻(xiàn)研究設(shè)定亞組分析，分別為低劑量組（0.5~0.7 g/mL）、中劑量組（1.0~1.2 g/mL）和高劑量組（1.4~2.4 g/mL）。鑒于精子活力、Fas、FasL、Johnson評分指標(biāo)納入文獻(xiàn)較少，故未進(jìn)行敏感性分析。對其余各項指標(biāo)進(jìn)行敏感性分析，結(jié)果顯示，各指標(biāo)的敏感性分析與原結(jié)果相同，且有較好的穩(wěn)定性。（見表3）

表3 15篇益氣活血類中藥對精索靜脈曲張動物模型生精細(xì)胞凋亡干預(yù)作用實驗研究中結(jié)局指標(biāo)Meta分析結(jié)果

2.4.1 精子密度8項研究[10,13,16,19-23]報告了精子密度水平。隨機(jī)效應(yīng)模型中Meta分析結(jié)果示，益氣活血類中藥可提升實驗后雄性模型大鼠的精子密度[SMD=2.63，95%CI（1.95，3.32），P＜0.000 01]。本研究進(jìn)一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 01）。

2.4.2 精子活率7項研究[10,13,16-17,19,21-22]報告了精子活率水平。固定效應(yīng)模型中Meta分析結(jié)果示，益氣活血類中藥可提高實驗后雄性模型大鼠的精子活率[SMD=2.38，95%CI（1.87，2.88），P＜0.000 01]。本研究進(jìn)一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 01）。

2.4.3 精子活力2項研究[13,23]報告了精子活力水平。固定效應(yīng)模型中Meta分析結(jié)果示，益氣活血類中藥可逐漸增強(qiáng)實驗后雄性大鼠的精子活力[SMD=2.88，95%CI（2.38，3.38），P＜0.000 01]。本研究進(jìn)一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 01）。

2.4.4 Bcl-2 4項研究[10,14-15,23]報告了Bcl-2水平。隨機(jī)效應(yīng)模型中Meta分析結(jié)果示，益氣活血類中藥可有效促進(jìn)實驗后雄性模型大鼠的Bcl-2表達(dá)水平，進(jìn)而抑制生精細(xì)胞凋亡[SMD=1.29，95%CI（1.02，1.57），P＜0.000 01]。本研究進(jìn)一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4.5 Fas 2項研究[10,15]報告了Fas水平。固定效應(yīng)模型中Meta分析結(jié)果示，益氣活血類中藥可在一定程度上降低實驗后雄性模型大鼠的Fas表達(dá)水平，繼而有效控制生精細(xì)胞凋亡進(jìn)程[SMD=-0.90，95%CI（-1.26，-0.54），P＜0.000 01]。本研究進(jìn)一步顯示，高、中劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）。低劑量組分別與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4.6 FasL 2項研究[10,15]報告了FasL水平。隨機(jī)效應(yīng)模型中Meta分析結(jié)果示，益氣活血類中藥可在一定范圍內(nèi)減少實驗后雄性模型大鼠的FasL表達(dá)水平，從而延緩生精細(xì)胞凋亡[SMD=-2.74，95%CI（-3.55，-1.94），P＜0.000 01]。本研究進(jìn)一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）。

2.4.7 AI 5項研究[11-14,24]報告了AI。文獻(xiàn)[12]與文獻(xiàn)[14]為同一作者相同實驗，AI指數(shù)數(shù)據(jù)一致，故納入其中1項研究的AI指數(shù)。隨機(jī)效應(yīng)模型中Meta分析結(jié)果示，益氣活血類中藥可下調(diào)實驗后雄性模型大鼠的AI[SMD=-1.53，95%CI（-1.88，-1.19），P＜0.000 01]。本研究進(jìn)一步顯示，高、中、低劑量組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 01）。

2.4.8 Johnson評分2項研究[18-19]報告了Johnson評分。隨機(jī)效應(yīng)模型中Meta分析結(jié)果示，益氣活血類中藥可有效提高實驗后雄性模型大鼠Johnson評分[SMD=0.46，95%CI（-1.35，2.26），P=0.01]。本研究進(jìn)一步顯示，高劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.34）。中劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01）。

2.5 文獻(xiàn)發(fā)表偏倚根據(jù)益氣活血類中藥對模型組精子密度、精子活率兩項結(jié)局指標(biāo)繪制漏斗圖，分別以納入研究的標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差SMD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)誤SE為縱坐標(biāo)。其中精子密度指標(biāo)屬于隨機(jī)效應(yīng)模型，故制作倒漏斗圖；精子活率指標(biāo)屬于固定效應(yīng)模型，故制作漏斗圖。圖2示，精子密度水平倒漏斗圖基本不對稱，可能存在一定偏倚；圖3示，精子活率水平漏斗圖稍不對稱，提示進(jìn)行Meta分析結(jié)果可靠性較高。

圖2 精子密度變化的倒漏斗圖

圖3 精子活率變化的漏斗圖

3 討 論

近年來，VC導(dǎo)致不育的關(guān)鍵細(xì)胞分子機(jī)制為睪丸內(nèi)生精細(xì)胞凋亡及凋亡異常增加，然而生精細(xì)胞凋亡在正常的生精過程中是存在的，以適當(dāng)維持支持細(xì)胞與生精細(xì)胞的數(shù)量平衡，并清除過多及DNA損害嚴(yán)重的生精細(xì)胞[25]。調(diào)控凋亡因子在精子發(fā)生過程中起到一定作用，Johnson評分與凋亡指數(shù)（AI）也可以體現(xiàn)凋亡因子與生精功能障礙存在相關(guān)性[26-27]。目前，相關(guān)研究表明由細(xì)胞膜上死亡受體（death receptor，DR）介導(dǎo)的死亡受體通路是細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制，F(xiàn)as、Fas配體（FasL）蛋白是該途徑的核心蛋白，能直接反映凋亡的狀態(tài)[28-29]。其次，有研究指出凋亡蛋白Bcl-2在成熟精子中具有強(qiáng)陽性的表達(dá)，并對凋亡有抑制作用[30]。通過VC模型模擬臨床發(fā)病，采取部分結(jié)扎左腎靜脈的方式建立VC模型，探究下游相關(guān)細(xì)胞凋亡是當(dāng)前對于生精細(xì)胞功能研究的主要途徑。目前，有學(xué)者運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘探討VC中醫(yī)治法規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，治以活血化瘀為主，兼以調(diào)理氣血，調(diào)節(jié)各臟腑功能[31]。另有研究指出益氣活血類中藥對于局部微循環(huán)改善有較好的調(diào)節(jié)作用，并對凋亡因子的調(diào)節(jié)也有一定程度的影響[32-34]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，益氣活血類中藥能夠有效提高精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2蛋白水平，降低Fas、FasL、AI，改善Johnson評分。此外，不同劑量的益氣活血類中藥對模型大鼠Bcl-2、Fas、AI和Johnson評分的影響存在療效差異，體現(xiàn)了一定的量效關(guān)系。

本研究存在以下局限：（1）盡管本研究納入了精子密度、精子活率等8個結(jié)局指標(biāo)的文獻(xiàn)，但受納入文獻(xiàn)質(zhì)量與數(shù)量因素的影響，尚不能系統(tǒng)全面地評價益氣活血類中藥干預(yù)VC模型的療效水平；（2）納入研究中出現(xiàn)重復(fù)數(shù)據(jù)，體現(xiàn)當(dāng)前此項研究具有團(tuán)隊單一、靶點(diǎn)單一、指標(biāo)單一的特點(diǎn)，這對分析結(jié)果的推廣造成不利影響；（3）其他作用類中藥亦對VC模型生精細(xì)胞凋亡具有較好療效，但本研究僅收集納入文獻(xiàn)中較具有代表性的益氣活血類中藥，在一定程度上Meta分析結(jié)果存在偏倚；（4）由于諸多研究者在中藥及復(fù)方干預(yù)實驗中對動物實驗系統(tǒng)評價方法認(rèn)識存在不足，繼而可能存在較高的異質(zhì)性及潛在的偏倚風(fēng)險，也導(dǎo)致相關(guān)文獻(xiàn)（含英文）因未提供具體指標(biāo)數(shù)據(jù)而不得納入；（5）目前尚未見有關(guān)中藥干預(yù)VC模型的Meta分析及系統(tǒng)評價，故本研究對文中部分指標(biāo)評價具有一定的風(fēng)險差異。

綜上所述，現(xiàn)有相關(guān)證據(jù)表明，益氣活血類中藥可有效提高VC模型睪丸及附睪組織精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2表達(dá)水平，并降低Fas、FasL、AI，改善Johnson評分。但納入的研究尚存在一定的方法學(xué)缺陷，還有待高質(zhì)量的隨機(jī)對照研究來予以驗證。