板藍(lán)根飲片炮制工藝研究*

李 恒，陳江平，甘力帆，雷玉婧，姚曉璇，劉燎原

（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

板藍(lán)根，別名靛根、藍(lán)靛根、靛青根等，為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根[1]。板藍(lán)根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其性寒，味苦，歸心、胃經(jīng)，是一味清熱解毒、涼血利咽的臨床常用中藥，用于瘟疫時(shí)毒，發(fā)熱咽痛，溫毒發(fā)斑，痄腮，爛喉丹痧，大頭瘟疫，丹毒，癰腫[1]?，F(xiàn)代研究表明，板藍(lán)根主要含有核苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)、生物堿類(lèi)等成分，核苷類(lèi)成分為板藍(lán)根抗病毒作用的有效部位之一，尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷均為板藍(lán)根中的核苷類(lèi)成分[2-4]。生物堿類(lèi)中的（R，S）-告依春也具有抗病毒的作用，尤其對(duì)流感病毒具有顯著的抑制活性[5-7]。

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部“板藍(lán)根”項(xiàng)下飲片炮制方法為“除去雜質(zhì)，洗凈，潤(rùn)透，切厚片，干燥”[1]，缺乏具體的工藝參數(shù)，不利于板藍(lán)根飲片的質(zhì)量控制。有關(guān)板藍(lán)根飲片炮制工藝研究的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)均較單一[7-8]，鮮見(jiàn)多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)板藍(lán)根飲片炮制工藝的報(bào)道。主成分分析（principal component analysis，PCA）是基于化學(xué)、數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)聯(lián)合交叉應(yīng)用的多元分析方法，由PEARSON[9]在1901年首次提出，PCA的本質(zhì)就是將數(shù)據(jù)的多元變量抽取出少量主成分，從而在能保留原始數(shù)據(jù)中絕大多數(shù)信息的情況下，使用盡可能少的主成分來(lái)表征復(fù)雜的原始數(shù)據(jù)[10-12]，其在中藥炮制研究中有著非常廣泛的應(yīng)用[13-15]。本研究以外觀(guān)性狀、水分、浸出物、（R，S）-告依春含量和4個(gè)特征峰的峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合主成分分析法，綜合評(píng)價(jià)不同炮制工藝對(duì)板藍(lán)根飲片質(zhì)量的影響，優(yōu)選板藍(lán)根飲片炮制工藝，為板藍(lán)根飲片規(guī)范炮制及質(zhì)量提升提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 試藥板藍(lán)根藥材（批號(hào)：YM1906006，產(chǎn)地：陜西）購(gòu)自陜西生生中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根。

1.2 試劑對(duì)照品尿苷（批號(hào)：wkq18042002，純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；腺苷（批號(hào)：110879-201703，純度99.7%）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)：111977-201501，純度93.6%）、（R，S）-告依春（批號(hào)：111753-201706，純度100%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 主要儀器Waters Arc型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；ME204E型萬(wàn)分之一天平、XP26型百萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；C21-WK2102型多功能電磁爐（美的集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 板藍(lán)根飲片的制備參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部“板藍(lán)根”項(xiàng)下方法[1]，本研究確定以下3種飲片炮制方法。A法：取板藍(lán)根藥材適量，除去雜質(zhì)，分別置于10倍投料量的冷水中浸泡1、2、4、8 h（樣品編號(hào)依次為：A1、A2、A3、A4），切厚片，50℃烘箱干燥12 h，篩去碎屑；B法：取板藍(lán)根藥材適量，除去雜質(zhì)，分別潤(rùn)制2、4、8、12、24、36 h（樣品編號(hào)依次為：B1、B2、B3、B4、B5、B6），切厚片，50℃烘箱干燥12 h，篩去碎屑；C法：取板藍(lán)根藥材適量，除去雜質(zhì)，分別蒸制0.5、1、2、3 h（樣品編號(hào)依次為：C1、C2、C3、C4），切厚片，50℃烘箱干燥12 h，篩去碎屑。按上述不同炮制工藝各制備3批樣品，不同炮制工藝的板藍(lán)根飲片外觀(guān)性狀見(jiàn)表1。由結(jié)果可知，采用冷水浸泡法和潤(rùn)制法制得的飲片，隨著炮制時(shí)間的增加，切制時(shí)會(huì)出現(xiàn)翹片，部分樣品產(chǎn)生異味，因此需要合理選擇炮制時(shí)間。

表1 不同炮制工藝的板藍(lán)根飲片外觀(guān)性狀

2.2 色譜條件[16]色譜柱Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0~5 min，1%A；5~30 min，1%→7%A；30~40 min，7%A），檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 對(duì)照品溶液的制備取尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷和（R，S）-告依春對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成含尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷和（R，S）-告依春各15.778、17.647、20.218、40.120 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備取板藍(lán)根飲片粉末（過(guò)四號(hào)篩）約1.0 g，精密稱(chēng)定，置于圓底燒瓶中，精密加入水50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，煎煮2 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5 精密度試驗(yàn)取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的RSD。結(jié)果4個(gè)色譜峰峰面積的RSD分別為0.87%、0.54%、0.79%、0.69%，保留時(shí)間RSD分別為0.13%、0.18%、0.12%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.4”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備0、2、4、6、8、12 h后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的RSD。結(jié)果4個(gè)色譜峰峰面積的RSD分別為2.41%、0.15%、0.71%、0.93%，保留時(shí)間RSD分別為0.24%、0.29%、0.19%、0.26%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取同一板藍(lán)根飲片，按“2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的RSD。結(jié)果4個(gè)色譜峰峰面積的RSD分別為4.40%、4.12%、2.78%、4.68%，保留時(shí)間RSD分別為0.22%、0.30%、0.21%、0.22%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 樣品分析取不同炮制工藝飲片，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以4種對(duì)照品為對(duì)照，對(duì)不同炮制工藝的板藍(lán)根飲片成分進(jìn)行比較，得到HPLC圖譜見(jiàn)圖1。由圖1可知，板藍(lán)根藥材及不同炮制工藝的飲片中均含有尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷和（R，S）-告依春4種成分。因此，本研究采用共有峰按取樣量折合的峰面積為指標(biāo)，比較板藍(lán)根炮制前后的成分變化。板藍(lán)根藥材及不同炮制工藝飲片的4個(gè)峰的平均色譜峰峰面積見(jiàn)表2。

表2 板藍(lán)根藥材及不同炮制工藝飲片共有峰平均峰面積結(jié)果（n=3）

圖1 板藍(lán)根藥材及不同炮制工藝飲片HPLC圖

2.9 水分、浸出物和（R，S）-告依春含量的測(cè)定水分測(cè)定法按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0832項(xiàng)下的烘干法，醇溶性浸出物測(cè)定法按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2201項(xiàng)下的熱浸法（溶劑為45%乙醇）[17]和2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部板藍(lán)根項(xiàng)下含量測(cè)定方法[1]對(duì)板藍(lán)根藥材和飲片樣品的水分、浸出物和（R，S）-告依春含量進(jìn)行測(cè)定。由結(jié)果可知，板藍(lán)根藥材及不同炮制品水分、浸出物和（R，S）-告依春含量分別在6.8%～12.1%、26.8%～45.9%、0.032%～0.234%之間，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。（見(jiàn)表3）

表3 板藍(lán)根藥材及不同炮制工藝飲片的水分、浸出物和（R，S）-告依春含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.10 主成分分析使用SPSS 19.0軟件，以浸出物、生物堿類(lèi)成分（R，S）-告依春含量及核苷類(lèi)成分尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷的平均峰面積為變量，以特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率為判定依據(jù)，對(duì)不同炮制方法的板藍(lán)根飲片進(jìn)行主成分分析。根據(jù)降維結(jié)果，共計(jì)算出2組主成分PC1和PC2，特征值分別為3.218、1.072。各成分方差貢獻(xiàn)值分別為64.361%、21.432%，累計(jì)貢獻(xiàn)值達(dá)到85.793%，具有較強(qiáng)的代表性，可用來(lái)評(píng)價(jià)板藍(lán)根不同炮制工藝飲片的質(zhì)量。

根據(jù)各因子載荷矩陣及特征值計(jì)算得分系數(shù)，進(jìn)一步得到PC1、PC2及總和得分（Y）方程式：

式中：ZX1、ZX2、ZX3、ZX4、ZX5分別為浸出物、（R，S）-告依春、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷的標(biāo)準(zhǔn)化值。

利用上式計(jì)算不同炮制工藝的板藍(lán)根飲片的綜合得分，并按結(jié)果高低進(jìn)行排序（見(jiàn)表3），得分越高，表示此炮制工藝條件下的板藍(lán)根飲片質(zhì)量越好。由圖2和表4可知，PC1主要反映了尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷和（R，S）-告依春的信息，PC2主要反映了浸出物的信息。不同炮制工藝的板藍(lán)根飲片綜合得分為：B4＞B2＞A3＞B5＞A4＞A2＞B6＞B3＞C4＞C3＞C2＞A1＞C1＞B1。結(jié)合外觀(guān)性狀，板藍(lán)根飲片最優(yōu)炮制工藝為潤(rùn)制12 h，切厚片，50℃干燥12 h。

表4 因子載荷矩陣

圖2 主成分因子分析圖

2.11 驗(yàn)證試驗(yàn)取板藍(lán)根藥材適量，采用“潤(rùn)制12 h，切厚片，50℃干燥12 h工藝”平行加工飲片樣品3份，分別按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷和（R，S）-告依春的平均峰面積分別為170 052、265 843、286 422、289 987（n=3）。同時(shí)按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》板藍(lán)根項(xiàng)下相關(guān)方法測(cè)定，水分、浸出物和（R，S）-告依春的平均含量分別為9.0%、36.9%、0.171%（n=3）。

3 討 論

從外觀(guān)性狀判斷，冷水浸泡4、8 h（A3、A4）和潤(rùn)制12 h（B6）的板藍(lán)根飲片有明顯異味，且切制時(shí)出現(xiàn)翹片，蒸制2、3 h（C3、C4）的板藍(lán)根飲片切制時(shí)也出現(xiàn)翹片。原因可能是由于藥材過(guò)度浸潤(rùn)，致使藥材所吸水分過(guò)多，甚至造成藥材變質(zhì)發(fā)黏，不易切制[18]。上述5種炮制工藝條件下的板藍(lán)根飲片水分、浸出物及（R，S）-告依春含量均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》板藍(lán)根項(xiàng)下相關(guān)要求，但其外觀(guān)性狀與標(biāo)準(zhǔn)存在一定差異，因此中藥飲片炮制應(yīng)關(guān)注外觀(guān)性狀，其是中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。

板藍(lán)根中生物堿類(lèi)成分（R，S）-告依春和核苷類(lèi)成分尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷均具有明顯的抗病毒活性，可干擾病毒核酸的合成[19-21]。本研究結(jié)果顯示，不同炮制工藝的板藍(lán)根飲片中尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春的峰面積及浸出物含量均比原藥材有明顯增加，其抗病毒活性成分的含量有較大提升，更有利于發(fā)揮臨床療效。飲片外觀(guān)性狀結(jié)合綜合評(píng)分結(jié)果顯示，潤(rùn)制法炮制的板藍(lán)根飲片整體質(zhì)量較好，可作為板藍(lán)根飲片的最優(yōu)炮制工藝。