miR-1-3p抑制肝癌細胞SMMC-7721增殖、遷移并誘導(dǎo)其凋亡*

劉雨潭，孔藝璇，王一同，蘇靜慧，盧鴻健，王梅梅，熊亞南△，章廣玲

(1.河北省慢性疾病重點實驗室/唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室/華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000；3.河北省醫(yī)工融合精準醫(yī)療重點實驗室，河北 唐山 063000)

肝癌是僅次于肺癌、結(jié)腸癌和胃癌的第4類癌癥相關(guān)致死原因，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝癌類型，占75%～90%，患者被檢出時多數(shù)已處于晚期，因此，治療及預(yù)后效果均較差[1-3]；尋找早診斷、早治療的靶點是目前研究的熱點之一。微小RNA(micro RNA，miRNA)是一組20～22堿基長度的非編碼RNA分子，是轉(zhuǎn)錄后水平上基因表達的負調(diào)控因子。miRNAs異常表達常見于多種人類惡性腫瘤。有研究表明，miRNA在細胞凋亡和生長乃至癌的轉(zhuǎn)移和侵襲過程中具有關(guān)鍵作用[4-5]。其中miR-1-3p參與了包括前列腺癌、膀胱癌、肺癌、結(jié)直腸癌等癌癥的發(fā)生、發(fā)展[6-9]；但在肝癌發(fā)病過程中的作用知之甚少。本研究通過檢測miR-1-3p及其預(yù)測靶基因在肝癌細胞系SMMC-7721中的表達水平，并結(jié)合過表達和敲低表達技術(shù)，探討了miR-1-3p對該腫瘤細胞系生物學(xué)行為的影響及其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pcDNA3和pcDNA3/pri-miR-1-3p均由天津醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)中心實驗室湯華教授贈予，NC inhibitor、miR-1-3p inhibitor均購自銳博生物公司；實驗用LO2和SMMC-7721細胞系均購自中國科學(xué)院上海細胞庫，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)、胰酶、抗青霉素和鏈霉素雙抗均購自美國Gibco公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒、Lipofectamine 2000 Reagent、Trizol Reagent、Opti-MEM細胞培養(yǎng)基均購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染

收集細胞后按8×105個/孔，體積為100 μL均勻接種于6孔板。補充含10%血清的DMEM，5%二氧化碳、37 ℃過夜。細胞密度到達板底面積的70%～90%。按照Lipofectamine 2000說明書分組轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系SMMC-7721：分為轉(zhuǎn)染pcDNA3/pri-miR-1-3p質(zhì)粒(miR-1-3p組)、轉(zhuǎn)染pcDNA3空載質(zhì)粒(pcDNA3組)、轉(zhuǎn)染miR-1-3p inhibitor(miR-1 inhibitor組)及其對照(NC inhibitor組)。

1.2.2分析miR-1-3p水平和臨床信息

登錄TCGA數(shù)據(jù)門戶下載肝癌相關(guān)miRNA和臨床信息。對比miR-1-3p在正常肝組織、原發(fā)及復(fù)發(fā)性肝癌組織中的水平，并對不同分期miR-1-3p的表達進行比較分析。采用單因素生存分析比較miR-1-3p與肝癌患者總生存率(overall survival,OS)的關(guān)系。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-1-3p及 CAAP1 mRNA的相對表達水平

轉(zhuǎn)染48 h后TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用qRT-PCR法測定miR-1-3p和CAAP1相對表達水平。使用時將獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物反應(yīng)液稀釋50倍后作為模板，U6 的上下游引物和所有miRNA的下游引物由miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒提供。miR-1-3p 上游：5′-GCC GTG GAA TGT AAA GAA GTA TG-3′，CAAP1 上游：5′-CTC CTT GCA GCA GGA AAC TA-3′，CAAP1 下游：5′-ATG ACA CAG TCA GGT CCA GT-3′。

1.2.4CCK-8實驗檢測增殖能力

細胞按照5×103個/孔均勻接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜。分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72、96 h吸凈原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育3 h后使用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測每孔的吸光度值[10]。

1.2.5集落形成能力檢測

SMMC-7721轉(zhuǎn)染48 h后800個/孔接種于12孔板，5%二氧化碳、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)14 d，吸出每孔培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS) 沖洗，再用1%結(jié)晶紫進行染色，細胞數(shù)大于或等于50可視為集落，觀察并計數(shù)[11]。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

SMMC-7721轉(zhuǎn)染48 h后重懸細胞，使用Annexin V-FITC試劑盒進行細胞凋亡檢測，加入AnnexinV-FITC和PI staining solution各5 μL，輕輕混勻，室溫放置，避光作用 10 min后用儀器檢測染色細胞。

1.2.7Western blot檢測蛋白水平

SMMC-7721轉(zhuǎn)染48 h后吸棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入300 μL RIPA裂解液，冰浴搖30 min，14 000 r/min離心。在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺上分離且轉(zhuǎn)移到聚丙稀酰胺膜上，加入抗caspase-3(1∶200)或抗CAAP1(1∶500)，4 ℃孵育過夜。用TBST洗3次，在室溫下與羊抗兔(1∶2 000)孵育2 h。1×TBST沖洗4次，每次5 min，同時配制ECL顯色液，避光。聚丙稀酰胺膜于顯影液反應(yīng)大概1 min后采用凝膠成像儀成像。采用ImageJ軟件分析條帶灰度。

1.2.8劃痕實驗檢測遷移能力

SMMC-7721轉(zhuǎn)染48 h后消化并計數(shù)，向24孔板中加入500 μL細胞懸液(8×104個)，每組3個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱24 h。用100 μL槍頭尖端進行劃痕創(chuàng)面處理，PBS清洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基，在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，培養(yǎng)24 h，用PBS洗3次，計算細胞遷移的平均距離和標(biāo)準差并繪制柱狀圖。

1.2.9Transwell檢測遷移和侵襲能力

1.2.9.1遷移能力

SMMC-7721細胞分組轉(zhuǎn)染48 h后用PBS清洗2次，0.25%胰酶消化、計數(shù)，按照5×104個/孔量至1.5 EP管中，離心后用 200 μL DMEM重懸細胞，移入Transwell上層小室，遷移下室加600 μL 20%血清的DMEM，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，結(jié)晶紫染色，顯微鏡計數(shù)。

1.2.9.2侵襲能力

先在上層小室預(yù)鋪一層 metrigel 膠(1 mg/mL)，通過細胞計數(shù)板計數(shù)，按照1×105個/孔的量至1.5 EP管中，離心后用 200 μL DMEM重懸細胞移入Transwell上室，加600 μL含30%血清的DMEM進行侵襲實驗。培養(yǎng)24 h后用棉簽輕輕擦去小室膜上方的細胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡計數(shù)。

1.2.10雙熒光素酶報告載體實驗驗證CAAP1是miR-1-3p的直接靶基因

構(gòu)建雙熒光報告載體pcDNA3/EGFP-miR-1-CAAP1-3′UTR和pcDNA3/EGFP-miR-1-CAAP1-3′UTR-mut載體，與pri-miR-1-3p共轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞在48孔板中。轉(zhuǎn)染48 h后用RIPA裂解液裂解細胞。測定蛋白樣品中EGFP(報告分子)和RFP(內(nèi)參)表達強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-1-3p在HCC中表達與預(yù)后的關(guān)系

原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤中miR-1-3p的表達較正常組織明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A；miR-1-3p在不同肝癌分期中的表達無顯著差異，見圖1B；miR-1-3p低表達水平與較短總生存期相關(guān)(P<0.05)，見圖1C。

A:肝癌組織與正常肝組織比較；B:在不同肝癌分期組織中的表達；C:miR-1-3p高表達患者與miR-1-3p低表達患者比較；*:P<0.05。

2.2 miR-1-3p在SMMC-7721細胞和LO2細胞中的表達

SMMC-7721中miR-1-3p相對表達水平明顯低于LO2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 過表達或沉默內(nèi)源性miR-1-3p后SMMC-7721中miR-1-3p的表達

miR-1-3p組miR-1-3p表達水平較pcDNA3組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-1 inhibitor組miR-1-3p表達水平較NC inhibitor組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 miR-1-3p對SMMC-7721細胞增殖的影響

miR-1-3p過表達抑制了SMMC-7721細胞增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4A；沉默miR-1-3p后促進了細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4B。

2.5 miR-1-3p對SMMC-7721細胞集落形成能力的影響

SMMC-7721中上調(diào)miR-1-3p組集落數(shù)明顯少于pcDNA3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；沉默miR-1-3p后集落形成數(shù)較NC inhibitor組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

*:P<0.05。

*:P<0.05。

A:miR-1-3p對SMMC-7721細胞增殖的影響；B:干擾miR-1-3p對SMMC-7721細胞增殖的影響;*:P<0.05。

2.6 miR-1-3p對SMMC-7721凋亡的影響

與pcDNA3組比較，miR-1-3p組明顯增強了細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。沉默miR-1-3p后SMMC-7721凋亡率明顯低于NC inhibitor組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6A；與pcDNA3組比較，miR-1-3p組cleaved caspase3蛋白水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NC inhibitor組比較，沉默miR-1-3p后cleaved caspase3蛋白水平明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6B。

*:P<0.05。

2.7 miR-1-3p對SMMC-7721遷移能力的影響

miR-1-3p組細胞遷移距離和遷移量均較pcDNA3組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；沉默miR-1-3p后細胞遷移距離和遷移量均較NC inhibitor組明顯增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

2.8 miR-1-3p對SMMC-7721細胞侵襲能力的影響

miR-1-3p組SMMC-7721侵襲量較pcDNA3組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；沉默miR-1-3p后細胞侵襲量較NC inhibitor組明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。

2.9 miR-1-3p對CAAP1靶向作用

利用miRDB、TargetScan、miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-1-3p與CAAP1-3′UTR上存在高度保守的互補序列，見圖9A；miR-1-3p與CAAP1-3′UTR-EGFP共轉(zhuǎn)染組EGFP/RPF熒光強度比值明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖9B；當(dāng)CAAP1的3′UTR與miR-1-3p結(jié)合區(qū)域突變后過表達miR-1-3p不能影響EGFP/RPF熒光強度。上調(diào)miR-1-3p可明顯降低CAAP1 mRNA和蛋白表達；相反下調(diào)miR-1-3p表達可提高SMMC-7721細胞中CAAP1 mRNA和蛋白相對表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖9C、D。

A:流式細胞術(shù)檢測；B:Western blot檢測；*:P<0.05。

A:劃痕實驗；B:Transwell實驗；*:P<0.05。

*:P<0.05。

A:序列比對；B:熒光素酶報告；C:RT-qPCR檢測；D:Western blot檢測；*:P<0.05。

3 討 論

miRNA過度表達或下調(diào)導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達失調(diào)，從而通過調(diào)節(jié)細胞增殖、血管生成和侵襲而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12]。miRNAs在許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中均被下調(diào)，包括肝癌[13]?；趍iRNA的肝癌發(fā)生、發(fā)展機制及治療靶點研究將會對肝癌的預(yù)防、診治具有重大意義。以往研究證實，miR-1-3p在多種癌癥組織中呈現(xiàn)低表達，通過人為干預(yù)致其過表達可抑制多種癌細胞的增殖和遷移[6-9]。然而，在肝癌細胞增殖、遷移乃至侵襲過程中miR-1-3p及其下游靶基因的作用有待于深入研究。

本研究中首先通過對TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌相關(guān)臨床數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計和分析，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，miR-1-3p在HCC患者中表達下調(diào)，且HCC患者miR-1-3p低表達預(yù)示生存率降低，意味著miR-1-3p在HCC的發(fā)生、發(fā)展中可能具有關(guān)鍵作用。在此基礎(chǔ)上本研究進一步通過體外培養(yǎng)肝癌細胞系SMMC-7721并給予miR-1-3p干預(yù)，結(jié)果顯示，miR-1-3p不僅抑制肝癌細胞SMMC-7721的增殖乃至集落的形成，對其遷移、侵襲能力也表現(xiàn)出一定的拮抗作用，同時促進了該細胞的凋亡。為進一步探索miR-1-3p對上述生物學(xué)功能的具體機制，尤其是關(guān)鍵靶向基因，本研究利用miRDB、TargetScan、miRanda數(shù)據(jù)庫篩選并推測miR-1-3p潛在靶向調(diào)控基因之一為CAAP1。CAAP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平上不同程度表達于人類來源的每個正常(成人和胎兒)和癌癥組織中，并表現(xiàn)出具有幾個良好保守結(jié)構(gòu)域的進化保留結(jié)構(gòu)。具體而言，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測CAAP1的中心區(qū)域與意味著在凋亡信號傳導(dǎo)中起作用的死亡效應(yīng)域共享結(jié)構(gòu)相似性。其作用需要相互依賴的caspase激活網(wǎng)絡(luò)。在A-549、MCF-7/casp3-10b細胞系中抑制CAAP表達可誘導(dǎo)細胞凋亡[14]。在Sézary綜合征檢測到CAAP1表達水平的變化。不同研究表明，CAAP1在不同疾病中表現(xiàn)出致癌基因的作用[15]。本研究雙熒光報告載體實驗雙熒光素酶報告載體實驗結(jié)果顯示，miR-1-3p直接與CAAP1的3′-UTR結(jié)合，證實miR-1-3p與CAAP1的靶向關(guān)系。qRT-PCR和Western blot實驗證實，miR-1-3p在mRNA乃至蛋白表達水平上負調(diào)控CAAP1表達。

綜上所述，本研究在證實了miR-1-3p對肝癌細胞SMMC-7721 的增殖、遷移和侵襲的明顯抑制作用基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)其作用機制可能是通過負調(diào)控CAAP1的表達抑制肝癌細胞的上述惡性生物學(xué)行為。提示miR-1-3p可能成為HCC新的治療靶點，為HCC臨床靶向治療提供了理論和實驗依據(jù)。