乙型肝炎病毒對(duì)miR-10b表達(dá)的影響及其生物信息學(xué)分析*

梁俐蘭，劉莉莉，覃超梅，梁 斌，石明連，劉永明，蘇何玲

(桂林醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西桂林 541100)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的急、慢性肝炎，肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球性的主要衛(wèi)生問題。全球慢性乙型肝炎患者約2.57億人，每年約887 000人死于HBV感染導(dǎo)致的肝硬化和HCC。近年來，HBV引起的宿主微小RNA(micro RNA,miRNA)表達(dá)變化及其在肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用已成為HBV感染相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)[1-2]。miRNA是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)部分序列同源性結(jié)合而誘導(dǎo)基因沉默，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，miRNA可影響HBV在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和基因表達(dá)，而HBV則可通過調(diào)節(jié)宿主miRNA表達(dá)為其提供生存與復(fù)制的有利環(huán)境[3-6]。這種miRNA介導(dǎo)的HBV與宿主的相互關(guān)系是HBV感染相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)。

miR-10b是新近被發(fā)現(xiàn)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的一種疾病相關(guān)性miRNA，在一些病毒性疾病的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用[7-9]。本研究分析美國(guó)生物技術(shù)信息中心(national Center for Biotechnology Information,NCBI)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫中的GSE19980和GSE121248數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，miR-10b在穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)。進(jìn)而提取HepG2.2.15細(xì)胞及其對(duì)照HepG2細(xì)胞的總RNA進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)，證實(shí)了HBV對(duì)miR-10b表達(dá)的上調(diào)作用。在此基礎(chǔ)上，對(duì)HBV上調(diào)miR-10b表達(dá)在肝臟疾病中的作用進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為研究miR-10b在HBV感染及其致病機(jī)制中的作用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株及穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞均購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。胰蛋白酶、高糖杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)、青霉素鏈霉素及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取試劑TRI Reagent購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司，反轉(zhuǎn)錄引物為試劑盒中的Oligo-dT adaptor primer， PCR反應(yīng)所用特異性引物由上海生工生物工程公司合成。普通PCR儀及熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1miRNA芯片GEO2R分析

從NCBI基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載miRNA表達(dá)芯片GSE19980。GSE19980 miRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集有12個(gè)樣本，6個(gè)細(xì)胞株HepG2(樣本編號(hào)：GSM499316～GSM499321)和6個(gè)表達(dá)HBV細(xì)胞株HepG2.2.15樣本(樣本編號(hào)：GSM499322～GSM499327)。采用GEO2R工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對(duì)GSE19980數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定義HepG2細(xì)胞為1組，HepG2.2.15細(xì)胞為2組，按P值從小到大排序，選取前250個(gè)具有顯著表達(dá)差異的miRNA執(zhí)行分析。將分析結(jié)果置于Echart(http://www.ehbio.com/ImageGP/)中制作火山圖，篩選差異miRNA。

從NCBI下載GSE121248 mRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集，GSE121248數(shù)據(jù)集是以慢性乙型肝炎誘導(dǎo)的HCC及其鄰近正常組織中分離出的組織，并提取總RNA進(jìn)行Affymetrix基因微陣列分析芯片，共有107個(gè)樣本，其中70個(gè)HCC樣本(樣本編號(hào)：GSM3428716～GSM3428785)，37個(gè)鄰近正常組織樣本(樣本編號(hào)：GSM3428786～GSM3428822)。采用GEO2R對(duì)GSE121248數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定義70個(gè)HCC樣本為1組，37個(gè)鄰近正常組織樣本為2組，按P值從小到大排序，選取P<0.001的差異表達(dá)基因進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素溶液的高糖DMEM、37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3miR-10b表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)

利用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000測(cè)量總RNA濃度及純度。miRNA逆轉(zhuǎn)錄按All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection試劑盒說明書操作，合成的第1鏈cDNA稀釋10倍后于Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件為95 ℃ 5 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進(jìn) 行35個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參。hsa-miR-10b上游引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTACCCTGTAGAACC-3′，內(nèi)參U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，qPCR檢測(cè)的通用下游引物為試劑盒中的Universal Adaptor PCR Primer。以2-ΔΔCt方法評(píng)估m(xù)iR-10b的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4miR-10b的靶基因預(yù)測(cè)

選擇TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)、miRDB (http://www.mirdb.org/)、DIANA TOOLS (http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php) 4種在線靶基因預(yù)測(cè)工具篩選出miR-10b的靶基因，使用在線工具Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制4個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶基因的韋恩圖，選取并集及交集靶基因用于后續(xù)分析。

1.2.5miR-10b靶基因的生物信息學(xué)分析

采用在線工具DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov/)對(duì)miR-10b的交集靶基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分析，選擇物種為Homo sapiens，背景也選擇 Homo sapiens，包括生物過程、分子功能、細(xì)胞組分3種類型。以P<0.05為顯著性閾值，富集分?jǐn)?shù)為-lg P，采用在線工具STRING (https://string-db.org/)對(duì)miR-10b的交集靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.2.6miR-10b靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述4個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析的miR-10b靶基因并集與GSE121248數(shù)據(jù)集GEO2R分析結(jié)果進(jìn)行Venny分析以獲得共同基因，并將結(jié)果上傳在線工具STRING (https://string-db.org/)，選擇物種為 human species，蛋白質(zhì)相互作用評(píng)分大于0.4執(zhí)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，將PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果導(dǎo)入Cystoscape，選取節(jié)點(diǎn)度大于10的蛋白與miR-10b的靶基因4個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)交集結(jié)果進(jìn)行Venny 2.1分析，獲得核心蛋白用于下一步分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HBV感染上調(diào)miR-10b的表達(dá)

hsa-miR-10b在穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。HepG2細(xì)胞miR-10b的相對(duì)表達(dá)水平[(0.980±0.079)]明顯低于穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞[(2.682±0.937)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。

2.2 miR-10b基因位點(diǎn)與序列保守性

在miRBase數(shù)據(jù)庫中檢索人miR-10b的位置及其他物種miR-10b成熟序列，人miR-10b定位于2q31.1(chr2:176150303-176150412)，其成熟序列為5′-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3′。將10種其他物種miR-10b成熟序列與人類相比較發(fā)現(xiàn)，不同物種miR-10b具有高度保守性，見表1。提示 miR-10b具有潛在的重要生物學(xué)功能。

2.3 miR-10b的靶基因預(yù)測(cè)

使用Targetscan、miRTarBase、miRDB、DIANA TOOLS 4種在線工具預(yù)測(cè)miR-10b的靶基因，分別為340、325、352、464個(gè)，見圖2。用Venny2.1軟件繪制韋恩圖篩選獲得23個(gè)交集靶基因，見圖3。作為后續(xù)分析的基因數(shù)據(jù)集見表2。

A:差異表達(dá)miRNA火山圖；B:HepG2與HepG2.2.15細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)水平比較；*：P<0.05，與HepG2.2.15細(xì)胞比較。

表1 不同物種的miR-10b的成熟序列

2.4 miR-10b靶基因數(shù)據(jù)集的GO及KEGG信號(hào)通路分析

miR-10b的23個(gè)靶基因參與了轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、囊泡、核質(zhì)部分等細(xì)胞組分；主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA代謝、基因表達(dá)等生物學(xué)過程，以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子活性和DNA結(jié)合等分子功能，見圖3。miR-10b的靶基因明顯富集在癌癥中蛋白多糖、癌癥中miRNA、晝夜節(jié)律及cAMP信號(hào)通路等相關(guān)通路中，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 交集的靶基因數(shù)據(jù)集

2.5 miR-10b靶基因編碼蛋白的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

miR-10b靶基因與慢性乙型肝炎誘導(dǎo)的HCC及其鄰近的正常組織基因芯片GSE121248數(shù)據(jù)集GEO2R分析結(jié)果進(jìn)行Venny分析獲得573個(gè)共同基因，并將此573個(gè)基因上傳在線工具STRING (https://string-db.org/)，分析573個(gè)基因表達(dá)蛋白之間的相互作用，去掉無相互作用的蛋白質(zhì)，獲得501個(gè)相互作用的蛋白，將STRING分析結(jié)果導(dǎo)入Cystoscape后執(zhí)行分析，選取節(jié)點(diǎn)度大于10共獲93個(gè)蛋白基因，將此93個(gè)基因與miR-10b 4個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)23個(gè)交集的靶基因進(jìn)行Venny 2.1分析獲得CREB1、GATA3、NCOA6、NCOR2、PIK3CA、MAPRE1、TIAM1 7個(gè)核心蛋白基因。

圖2 miR-10b的靶基因預(yù)測(cè)

A:細(xì)胞組分分析；B:生物學(xué)過程分析；C:分子功能分析；D:KEGG pathway分析。

3 討 論

盡管越來越多的研究表明，miR-10b在一些病毒性疾病的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用，但其在HBV感染所致疾病中的作用仍鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過分析NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，miR-10b在HBV感染肝細(xì)胞株HepG2.2.15中的表達(dá)明顯升高。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，HepG2.2.15細(xì)胞miR-10b的表達(dá)水平明顯高于HepG2細(xì)胞。表明HBV感染可上調(diào)細(xì)胞miR-10b的表達(dá)。

MiR-10b在生物學(xué)方面具有重要功能。比對(duì)人類、小家鼠、獼猴、黑猩猩和牛等不同物種miR-10b序列的結(jié)果顯示，其序列高度保守。實(shí)際上GO分析顯示，miR-10b的靶基因一是生物過程方面與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA代謝和基因表達(dá)等相關(guān)；二是分子功能方面與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子活性和DNA結(jié)合等相關(guān)；三是細(xì)胞組分方面與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、囊泡和核質(zhì)部分等相關(guān)。KEGG信號(hào)通路分析提示，miR-10b的靶基因明顯富集在癌癥中蛋白多糖、癌癥中miRNA、晝夜節(jié)律及cAMP信號(hào)通路等相關(guān)通路中。以GEO2R分析慢性乙型肝炎誘導(dǎo)的HCC及其鄰近正常組織基因芯片GSE121248數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因與miR-10b靶基因進(jìn)行Venny 2.1分析，獲得了與HBV感染相關(guān)的miR-10b靶基因，進(jìn)而STRING分析基因表達(dá)蛋白的相互作用確定了7個(gè)核心蛋白基因，分別為CREB1、NCOA6、NCOR2、PIK3CA、GATA3、MAPRE1和TIAM1。

CREB是正常細(xì)胞中許多重要信號(hào)傳導(dǎo)通路的最終調(diào)節(jié)因子，在小鼠胰島素分泌細(xì)胞INS-1中敲除CREB則上調(diào)caspase-3基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。CREB可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)因子——胰島素受體底物-2(insulin receptor substrate-2，IRS-2)和神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4(neuronal PAS domain protein 4,NPAS4)表達(dá)促進(jìn)β細(xì)胞增殖[11]及存活[12-13]。此外，CREB可增強(qiáng)核心囊泡跨膜蛋白IA-2基因的表達(dá)促進(jìn)胰島素分泌[14]。NCOA6是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，NCOA6可調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞中Nampt基因刺激胰島素分泌[15]。磷酸肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/磷脂酰3,4,5三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)是胰島素信號(hào)作用的重要信號(hào)途徑[16-19]，介導(dǎo)了所有細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)?；罨腜I3K亞基可解除糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK-3)對(duì)糖原合成酶的抑制作用，促進(jìn)肝糖原的合成，PI3K-C2γ敲除則導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟糖原積累嚴(yán)重降低[20]。PI3K可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)囊泡中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)肌肉及脂肪組織葡萄糖的吸收[21-24]。miR-10b對(duì)CREB1和NCOA6的靶向作用可能降低胰島β細(xì)胞的活性、下調(diào)胰島素基因的表達(dá)及抑制胰島素的分泌。miR-10b對(duì)PIK3CA的靶向作用可能會(huì)促進(jìn)肝臟中糖原的分解，并阻止骨骼肌和脂肪組織中的葡萄糖攝取，從而導(dǎo)致機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)受損。這些研究結(jié)果顯示，miR-10b參與了調(diào)節(jié)胰島素分泌及葡萄糖攝取的生理過程。近年來，國(guó)內(nèi)外研究表明，HBV感染可誘發(fā)2型糖尿病或增加2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[25-26]。新近有研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染與妊娠糖尿病相關(guān)，可增加妊娠糖尿病發(fā)病率[27-28]。慢性HBV感染合并非酒精性脂肪肝患者普遍具有胰島素抵抗[29]。這些研究結(jié)果與miR-10b靶基因的生物信息學(xué)分析相吻合。miR-10b的其他靶基因編碼蛋白如GATA3被報(bào)道在脂肪形成和炎癥中具有重要作用[30]。新近有研究指出，其可作為胰島素抵抗和2型糖尿病的潛在治療靶標(biāo)[31]。而miR-10b靶基因Tiam1和Mapre1編碼蛋白TIAM1和MAPRE1分別被報(bào)道與腫瘤的侵襲性有關(guān)[32]和促進(jìn)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程[33]。

綜上所述，HBV感染可上調(diào)細(xì)胞miR-10b的表達(dá)，而異常表達(dá)的miR-10b可能通過靶向沉默CREB1、NCOA6、NCOR2、PIK3CA、GATA3、MAPRE1、TIAM1等蛋白基因損害機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，產(chǎn)生組織炎癥及促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展，從而在HBV感染的肝臟疾病中發(fā)揮著重要作用。因此，HBV感染對(duì)miR-10b表達(dá)的影響及其在肝臟疾病的作用值得深入研究。