腰腎膏指紋圖譜研究

杜藹媚，郭韻妍，招嘉文，李慧華

國藥集團德眾（佛山）藥業(yè)有限公司，廣東 佛山 528000

腰腎膏為肉蓯蓉、八角茴香、熟地黃、補骨脂、淫羊藿、蛇床子等2 種中藥，加上樟腦、冰片、薄荷素油、肉桂油、水楊酸甲酯、鹽酸苯海拉明、白凡士林、橡膠等原輔料，使用現代中藥制劑技術制成的橡膠膏劑，具有溫腎助陽、強筋壯骨、祛風止痛的作用，用于腎虛型腰膝酸痛、肌肉酸痛、夜尿的治療。

腰腎膏現執(zhí)行標準為國家藥品標準WS3-B-3514-98-2003，標準對處方中復雜多樣的藥材質量控制未作全面檢測與分析。為了全面控制腰腎膏的質量，本研究參照中藥注射劑指紋圖譜的要求[1]，及參考相關文獻[2-6]，以腰腎膏為對象，經實驗對比后得出采用水蒸氣蒸餾、乙酸乙酯收集揮發(fā)性成分，50%甲醇提取膏體中成分最為合適，后分別用氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）對上述提取物進行指紋圖譜研究，建立了2 個腰腎膏指紋圖譜，為腰腎膏整體質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100 型高效液相色譜儀、7890B 型氣相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Dionex U3000型高效液相色譜儀、Chromeleon 色譜工作站、Openlab 2.0色譜工作站（美國賽默飛世爾科技有限公司）；BRANSON 5510 型超聲清洗機［必能信超聲（上海）有限公司］；KQ-400DE型超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；明澈-D24型純水機（Millipore公司）；SQP型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

腰腎膏［國藥集團德眾（佛山）藥業(yè)有限公司，批號分別為18002、18008、18011、18022、18024、18026、18031、18032、18036、18038、18042、18046、18047、18052、18049、19001、19003、19004、19008、19009、19010］；樟腦（梧州黃埔化工藥業(yè)有限公司，批號：Yz1715041）；薄荷素油（黃山天目薄荷藥業(yè)有限公司，批號：180208）；肉桂油（福建中益制藥有限公司，批號：171001）；水楊酸甲酯（佛山市南海中南藥化廠，批號：170907）；冰片（株洲松本藥業(yè)有限公司，批號：171203）。

藥材和飲片經國藥集團德眾（佛山）有限公司中藥材鑒定師梁健徽鑒定均為正品，且符合《中華人民共和國藥典》2020年版標準，見表1。

表1 實驗所使用飲片信息

甲醇、乙腈（Fisher Scientific，色譜純）；三氟乙酸（Shanghai Macklin Biochemical Co.，Ltd.，分析純）；甲醇、無水乙醇、乙醇（廣東光華科技股份有限公司，分析純）；乙酸乙酯（廣東光華科技股份有限公司、江蘇強盛功能化學股份有限公司，分析純）；無水硫酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；萘（天津福晨化學試劑廠，分析純）；環(huán)己烷（天津永大化學試劑有限公司，分析純）。

對照品薄荷腦（批號：110728-201707，純度：99.8%）、桉油精（批號：110788-201707，純度：100%）、丁香酚（批號：110725-201716，純度：99.6%）、反式茴香腦（批號：111835-201503，純度：99.7%）、龍腦（批號：110881-201709，純度：99.6%）、桂皮醛（批號：110710-201821，純度：99.6%）、蛇床子素（批號：110822-201710，純度：99.5%）、補骨脂素（批號：110739-201617，純度：99.7%）、（-）-薄荷酮（批號：117705-201105，純度：99.8%）、異補骨脂素（批號：110738-200511，純度：100.0%）均購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 氣相色譜條件 ZB-WAX 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氮氣；流速為1 mL·min-1；進樣口溫度為200 ℃；分流比為10∶1；檢測器溫度為280 ℃；進樣量為1 μL；柱溫起始溫度為90 ℃，保持7 min，以10 ℃·min-1升至115 ℃，保持10 min，再以3 ℃·min-1升至150 ℃，再以0.5 ℃·min-1升至160 ℃，最后以10 ℃·min-1升至240 ℃，并保持30 min。

2.1.2 高效液相色譜條件 Welch Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，0.02%三氟乙酸為流動相B，進行梯度洗脫（0～55 min，85%B；55～65 min，85%～53%B；65～80 min，53%～50%B；80～87 min，50%～35%B；87～97 min，35%～27%B）；檢測波長：245 nm；進樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

氣相色譜供試品溶液：取腰腎膏3 片，剪成條狀，除去蓋襯，疏松黏結成團，加水100 mL 與玻璃珠數粒，置燒瓶中，連接揮發(fā)油測定器，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，加入乙酸乙酯2 mL，連接回流冷凝器，置電熱套中加熱回流3 h。放冷，將揮發(fā)油提取器的乙酸乙酯層放入分液漏斗中，再分別用乙酸乙酯2、2、1 mL 沖洗揮發(fā)油提取器，洗液并入分液漏斗中，靜置，棄去水層，乙酸乙酯層通過載有無水硫酸鈉1 g的濾紙，濾入10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，即得。

高效液相色譜供試品溶液：取出提取后的膏體于105 ℃烘干，剪碎，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇90 mL，超聲60 min，放冷，為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

氣相色譜指紋圖譜用對照品溶液：?。?）-薄荷酮適量加無水乙醇溶解制成5 mg·mL-1的對照品溶液；取桉油精適量，加無水乙醇溶解成0.15 mg·mL-1的對照品溶液；取丁香酚適量加環(huán)己烷溶解成2 mg·mL-1的對照品溶液；取薄荷腦30 mg至10 mL量瓶中，加萘內標液（取萘適量加無水乙醇制成1.8 mg·mL-1的溶液）溶解至刻度作為對照品溶液；取反式茴香腦適量加乙醇溶解成0.5 mg·mL-1的對照品溶液；取龍腦適量加乙酸乙酯溶解成4 mg·mL-1的對照品溶液。

高效液相色譜指紋圖譜用對照品溶液：取五味子醇甲適量加甲醇溶解成0.4 mg·mL-1的對照品溶液；取蛇床子素適量加甲醇溶解成0.03 mg·mL-1的對照品溶液；取補骨脂素及異補骨脂素適量加甲醇溶解成0.02 mg·mL-1的對照品溶液；取甘草酸銨適量加甲醇溶解成0.02 mg·mL-1的對照品溶液。

2.4 供試品溶液與陰性供試品溶液的制備

按腰腎膏處方比例取處方各味中藥適量，分別按2.2 項下方法制備氣相色譜指紋圖譜和高效液相色譜指紋圖譜研究用的供試品溶液。

高效液相色譜用陰性供試品溶液：按腰腎膏處方比例和工藝分別制備各味中藥的陰性樣品，按2.2項下方法制備高效液相色譜用陰性供試品溶液。

3 方法學考察

3.1 高效液相色譜方法學考察

3.1.1 精密度試驗 取腰腎膏（批號：18046），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.2 項下條件連續(xù)進樣測試6 次，以蛇床子素的保留時間和峰面積作為參照，記錄色譜圖，導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版，計算相似度，結果測得相似度均為1，說明儀器精密度良好。

3.1.2 重復性試驗 取腰腎膏（批號：18046）6份，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.2項下條件進樣測試，記錄色譜圖，導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版，計算相似度，結果測得相似度均為0.999，說明該方法重復性良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗 取腰腎膏（批號：18046）高效液相色譜供試品溶液，分別于0、12、29、41 h，按2.1.2 項下條件進樣測試，記錄色譜圖，導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版，計算相似度，結果測得腰腎膏高效液相色譜供試品溶液在41 h 內，各時間點進樣得到的色譜圖相似度分別為0.995、0.995、0.998、0.999，表明高效液相色譜供試品溶液中各成分在41 h內穩(wěn)定性良好。

3.2 氣相色譜方法學驗證

3.2.1 精密度試驗 取腰腎膏（批號：18046），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下條件連續(xù)進樣測試6 次。以水楊酸甲酯的保留時間和峰面積作為參照，記錄色譜圖，導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版，計算相似度，結果相似度均為1，說明儀器精密度良好。

3.2.2 重復性試驗 取腰腎膏（批號：18046）6份，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下條件進樣測試，記錄色譜圖，導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版，計算相似度，結果相似度分別為1.000、1.000、0.999、1.000、1.000、1.000，說明該方法重復性良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗 取腰腎膏（批號：18046）氣相色譜供試品溶液，分別于0、9、17、29 h，按2.1.1 項下條件進樣測試，記錄色譜圖，導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版，計算相似度，結果測得腰腎膏高效液相色譜供試品溶液在29 h 內，各時間點進樣得到的色譜圖相似度分別為0.995、0.995、0.998、0.999，表明氣相色譜供試品溶液中各成分在29 h內穩(wěn)定性良好。

4 腰腎膏指紋圖譜的建立與相似度評價

取20批腰腎膏，分別按2.2項下方法制備供試品溶液。

4.1 高效液相色譜指紋圖譜

按2.1.2項下條件進樣測定，記錄色譜圖。導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012版，計算相似度，各批腰腎膏色譜圖相似度為0.912～0.990（表2），生成腰腎膏高效液相色譜指紋對照圖譜（圖1）。得到52個共有峰。

圖1 腰腎膏高效液相色譜指紋圖譜及對照圖譜

表2 20批腰腎膏高效液相色譜指紋圖譜相似度

取高效液相色譜供試品溶液、陰性供試品、對照品溶液按2.1.2 項下條件進行測定，記錄各色譜峰保留時間，從而指認指紋譜圖中共有峰，其中得到歸屬的特征峰見表3。

表3 高效液相色譜指紋圖譜特征峰歸屬對應藥材來源

4.2 氣相色譜指紋圖譜

按2.1.1 項下條件進樣測定，記錄色譜圖導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012版，計算相似度（0～4 min溶劑峰不參與相似度評價），各批次相似度為0.997～1.000（表4），生成腰腎膏氣相色譜指紋對照圖譜（圖2）。取氣相色譜供試品溶液、對照品溶液按2.1.1 項下條件進行測定，記錄各色譜峰保留時間，從而指認指紋譜圖中共有峰，其中得到歸屬的特征峰見表5。

圖2 腰腎膏氣相色譜指紋圖譜及對照圖譜

表4 20批腰腎膏氣相色譜指紋圖譜相似度

5 討論

5.1 樣品前處理

腰腎膏作為橡膠膏劑，膏體基質較復雜，單純用頂空或者超聲提取并不能全面地評價其成分組成。通過揮發(fā)油提取器使其揮發(fā)油成分與膏體分離，剩余膏體用50%甲醇提取，把復雜的成分分為2個部分，減少了后續(xù)分離的難度。

使用揮發(fā)油提取器分離揮發(fā)性成分時考察了2、3、4、5 h 4 個提取時間，經對比后發(fā)現，提取2 h后的膏體內仍有揮發(fā)油的干擾；而在3 h后的高效液相色譜圖趨向一致，但從氣相色譜看出，提取時間過長會使部分峰面積變小，有效成分有所損失，故選擇3 h作為揮發(fā)油提取時間。揮發(fā)油提取試驗曾分別使用乙酸乙酯和環(huán)己烷作為萃取溶劑，得到的色譜圖一致。

本品工藝制法為中藥用乙醇提取濃縮為稠膏，稠膏與輔料基質混合涂布于彈性布上，剪切成7 cm×10 cm 即得。因此，膏體經過蒸煮3 h 后的水浸液中可溶性成分較少，需要選擇合適的溶劑進行下一步提取。提取完揮發(fā)油的膏體最初選擇50%乙醇、乙醇、甲醇為提取溶劑，發(fā)現高效液相色譜指紋圖譜中輔料峰較多，帶來一定程度的干擾，隨后將提取溶劑改為50%甲醇，提取得到的輔料峰較少，故選擇50%甲醇進行提取，輔料峰在積分過程中需剔除，不參與指紋圖譜評價。氣相色譜供試品溶液檢測結果顯示，基質萜烯樹脂在氣相色譜指紋圖譜中有明顯的色譜峰，因此，積分過程需剔除，不參與指紋圖譜評價。

5.2 色譜條件的優(yōu)化

高效液相色譜指紋圖譜研究過程中，通過對同品牌、同型號DE 3 根色譜柱Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、不同品牌的4 根色譜柱Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo Aypersil Gol C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-Phengl（250 mm×4.6 mm，5 μm），不同長度2 根色譜柱Welch Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行比較，發(fā)現苯基柱分離度差，同品牌C18色譜柱重現性良好，不同品牌C18色譜峰局部出峰順序或大小不一，故宜選擇Welch Ultimate、長度為250 mm 的色譜柱，保證峰形和出峰時間與腰腎膏高效液相色譜對照指紋圖譜接近。通過對供試品溶液在210～400 nm 波長進行掃描，發(fā)現在波長245 nm 色譜峰較多，峰大小較均衡。故選擇245 nm為檢測波長。

流動相使用磷酸、醋酸、甲酸、三氟乙酸作為水相流動相，經對比發(fā)現三氟乙酸與乙腈配合得到的分離度較好。

在不同高效液相色譜儀（Agilent 1100 型高效液相色譜儀、Thermo U3000 型高效液相色譜儀）上運行該色譜條件，同一樣品得到色譜圖與標準指紋圖譜的相似度分別為0.972、0.970，兩者RSD<0.2%，重復性良好。

氣相色譜指紋圖譜研究過程中，使用了HP-5、ZB-WAX、HP-FFAP、DB-1 毛細管色譜柱進行成分的分離，經比較后發(fā)現，ZB-WAX 色譜柱分離度較好，HP-FFAP色譜柱分離度雖合適但出峰時間慢。

5.3 指紋圖譜相似度比較

將20批供試品色譜圖導入“中藥指紋圖譜色譜相似度評價系統(tǒng)”2012版計算色譜圖相似度，氣相色譜指紋圖譜以水楊酸甲酯作為參照峰，得到了51個共有峰，對其中20 個共有峰進行了藥材歸屬，相似度為0.990～1.000；高效液相色譜指紋圖譜以蛇床子素作為參照峰，得到了52個共有峰，對其中20個共有峰進行了藥材歸屬，相似度為0.912～0.990。

腰腎膏處方藥材多達20 種，方中加入樟腦、水楊酸甲酯、薄荷素油等具有揮發(fā)性和促進透皮吸收的化學成分。本測定方法穩(wěn)定、簡便，可為腰腎膏制劑及同類劑型的整體化學成分研究提供參考。