雙標(biāo)線性校正法應(yīng)用于西洋參破壁飲片的指紋圖譜研究△

于現(xiàn)花，劉軍玲，張亞中，金傳山

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051

西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根，原產(chǎn)地主要是美國(guó)與加拿大，我國(guó)從17 世紀(jì)開始引進(jìn)種植。其現(xiàn)已成為我國(guó)傳統(tǒng)滋補(bǔ)藥材。西洋參味甘、微苦，性涼，歸心、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津作用，用于氣虛陰虧、虛熱煩倦、咳喘痰血、內(nèi)熱消渴、口燥咽干[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，西洋參中含有多種有效成分，具有抗腫瘤、抗癌、降血壓、調(diào)血脂、抗疲勞等多種藥理活性[2-4]。

西洋參破壁飲片是將傳統(tǒng)飲片細(xì)胞壁打破，通過現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)粉碎加工成D90（樣品累積分布百分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑）<45 μm 的粉體，再用無添加賦形技術(shù)制成30～100 目的顆粒新型中藥飲片。破壁飲片可使中藥的有效成分得到更充分釋放，進(jìn)而大幅提高藥效。與傳統(tǒng)飲片相比，西洋參破壁飲片具有全成分保留，成分利用率高，質(zhì)量均一，服用方式簡(jiǎn)單、快捷、靈活等特點(diǎn)[5-9]。近年來，破壁粉碎技術(shù)在中藥領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛，中藥破壁飲片品種逐漸增多，對(duì)破壁飲片的評(píng)價(jià)、產(chǎn)業(yè)化及應(yīng)用等方面的研究已成為中藥傳統(tǒng)飲片傳承與改良創(chuàng)新的熱門方向，并取得了一定成果。

由于外觀性狀及顯微特征已被破壞，傳統(tǒng)飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已不適用于破壁飲片質(zhì)量控制要求[10]。另因西洋參特有成分?jǐn)M人參皂苷F11為弱紫外吸收成分，因此，需要建立高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器（HPLC-CAD），用于西洋參傳統(tǒng)飲片與破壁飲片的指紋圖譜分析。目前，指紋圖譜研究較為單一，一般僅在1 根色譜柱上開展分析，后續(xù)難以適用到其他色譜柱或用相對(duì)保留時(shí)間法進(jìn)行色譜峰的定性，其預(yù)測(cè)保留時(shí)間絕對(duì)偏差較大，實(shí)用性不佳。本實(shí)驗(yàn)采用雙標(biāo)線性校正法[11-14]預(yù)測(cè)特征峰的保留時(shí)間，據(jù)此建立的西洋參破壁飲片指紋圖譜可以適用于不同色譜柱，既擴(kuò)展了方法的適用范圍，又降低了對(duì)照品的使用成本，為西洋參破壁飲片質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex公司）；XP26 型百萬分之一電子分析天平（Mettler公司）；A11 型分析研磨機(jī)（IKA 公司）；KQ-100 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Simplicity-185型超純水儀（Millipore公司）。

16根色譜柱，編號(hào)col 1～col 16，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm。col 1：Agilent TC-C18（2）；col 2：Diamonsil C18；col 3：GL Wondasil C18；col 4：Innoval C18；col 5：Inspire C18；col 6：JADE-PAK ODS-AQ；col 7：Kromasil 100 5-C18；col 8：Luna C18（2）100A；col 9：Shim-pack VP-ODS；col 10：Sonoma C18（2）100A；col 11：Tech Mate C18ST；col 12：Waters Symmetry C18；col 13：ZORBAX Eclipse XDB C18；col 14：ZORBAX SB C18；col 15：Waters XBridge C18；col 16：Kinetex C18100A。

對(duì)照品擬人參皂苷F11（批號(hào)：110841-200505，純度≥98%）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-201128，純度≥93.4%）、人參皂苷Re（批號(hào)：110754-201626，純度≥92.7%）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-201122，純度≥92.9%）、人參皂苷Rc（批號(hào)：110021-14-0，純度≥98%）、人參皂苷Rb2（批號(hào)：111715-200501，純度≥98%）、人參皂苷Rb3（批號(hào)：111686-200501，純度≥98%）、人參皂苷Rd（批號(hào)：111818-201001，純度≥94.4%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；DRS Origin 軟件由中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院設(shè)計(jì)研發(fā)，科邁恩（北京）科技有限公司開發(fā)；乙腈和甲醇為色譜純；正丁醇為分析純；水為超純水。

10 批西洋參（編號(hào)XYS-01～XYS-10）均購于安徽宏信藥業(yè)發(fā)展有限公司，經(jīng)安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院張亞中主任中藥師鑒定為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），線性梯度洗脫（0～5 min，81% B；5～25 min，81%～78%B；25～30 min，78%～74%B；30～55 min，74%～50%B；55～60 min，50%～81%B）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；CAD 霧化器溫度：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。上述條件下，各成分分離較好。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各人參皂苷對(duì)照品適量，置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成含人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及擬人參皂苷F11分別為0.042 8、0.130 1、0.035 3、0.056 4、0.025 0、0.029 7、0.061 2、0.097 7 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取供試品1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超聲（250 W，50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取2.2 項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣10μL。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及擬人參皂苷F11峰面積的RSD 分別為1.70%、0.30%、0.78%、0.84%、0.49%、0.91%、0.68%、1.55%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品（XYS-02）粉末，分別按2.3 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算其含量。樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及擬人參皂苷F11各含量的RSD分別為0.98%、1.12%、1.08%、1.35%、0.79%、1.02%、1.31%、0.45%，表明本法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新制備的供試品溶液（XYS-02），室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd及擬人參皂苷F11峰面積的RSD分別為1.27%、0.96%、1.68%、1.44%、1.64%、0.85%、1.26%、0.43%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 西洋參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片相似度評(píng)價(jià)分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012 版軟件，中位數(shù)法（時(shí)間窗為0.1）分別建立西洋參破壁飲片及傳統(tǒng)飲片指紋圖譜共有模式。結(jié)果顯示，西洋參破壁飲片及傳統(tǒng)飲片指紋圖譜均標(biāo)定17 個(gè)共有峰，并指認(rèn)出1 號(hào)峰為人參皂苷Rg1、2 號(hào)峰為人參皂苷Re、3 號(hào)峰為擬人參皂苷F11、4 號(hào)峰為人參皂苷Rb1、5 號(hào)峰為人參皂苷Rc、6 號(hào)峰為人參皂苷Rb2、7 號(hào)峰為人參皂苷Rb3、8號(hào)峰為人參皂苷Rd，結(jié)果見圖1。計(jì)算10 批破壁飲片與傳統(tǒng)飲片之間的相似度。結(jié)果顯示，各批破壁飲片與傳統(tǒng)飲片之間的相似度均大于0.939（表1）?？梢?，不同批次間破壁飲片產(chǎn)品均一性和穩(wěn)定性較好。由圖2 可知，各批次破壁飲片與傳統(tǒng)飲片之間的關(guān)聯(lián)性較好，也說明西洋參傳統(tǒng)飲片制成破壁飲片后，各主要成分均較定，體現(xiàn)了破壁飲片與原傳統(tǒng)飲片的物質(zhì)基礎(chǔ)一致，保留飲片全成分的特性。

圖1 對(duì)照品、西洋參傳統(tǒng)飲片供試品和破壁飲片供試品色譜圖

圖2 西洋參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜

表1 10批西洋參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片之間的相似度

2.6 雙標(biāo)線性校正法定性研究

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間（SRT）的計(jì)算 液相色譜中，化學(xué)成分在不同色譜儀和不同色譜柱上的保留時(shí)間具有線性關(guān)系[15]。通過對(duì)照品的保留時(shí)間進(jìn)行色譜峰定位，得到樣品實(shí)際保留時(shí)間，以15 根色譜柱得到的對(duì)照品保留時(shí)間平均值作為SRT[16]。分別以8 個(gè)成分的SRT 為橫坐標(biāo)，依次為人參皂苷Rg132.271 min、人參皂苷Re 32.791 min、擬人參皂苷F1142.371 min、人參皂苷Rb143.933 min、人參皂苷Rc 44.881 min、人參皂苷Rb245.833 min、人參皂苷Rb346.142 min、人參皂苷Rd 47.977 min。以實(shí)際保留時(shí)間為縱坐標(biāo)，得到各色譜柱的保留時(shí)間擬合結(jié)果，見圖3，各色譜柱的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

圖3 不同色譜柱保留時(shí)間關(guān)系

由圖3 和表2 可見，col 15 色譜柱的保留時(shí)間擬合直線相對(duì)有偏離，說明成分在col 15色譜柱相較于其他色譜柱保留時(shí)間相差較大。余下col 1～col 14 色譜柱相關(guān)系數(shù)均在0.999 以上，說明這14 根色譜柱的保留時(shí)間的線性關(guān)系良好，可用于西洋參破壁飲片的定性評(píng)價(jià)分析。

表2 不同色譜柱上保留時(shí)間的線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.6.2 雙標(biāo)化合物的確定 通過DRS Origin 軟件的計(jì)算，篩選出了10種雙標(biāo)選擇方案（表3），10種方案色譜柱符合率均達(dá)到95%，其中峰2～6 組合的預(yù)測(cè)正確率及色譜柱符合率均為100%，且保留時(shí)間回歸偏差最小。在未知色譜柱（以col 16 為驗(yàn)證柱）上運(yùn)行雙標(biāo)對(duì)照品溶液和供試品溶液，將人參皂苷Re 和人參皂苷Rb2作為西洋參破壁飲片液相色譜的雙標(biāo)化合物，以這2 個(gè)成分的SRT 為橫坐標(biāo)，實(shí)際保留時(shí)間人參皂苷Re 32.791 min、人參皂苷Rb245.833 min 為縱坐標(biāo)，得到2 點(diǎn)人參皂苷Re（32.791、31.628）和人參皂苷Rb2（45.833、44.491），做一直線，得到方程Y=0.986 3X-0.712 9，然后將其余6 個(gè)成分的SRT 值代入方程，得到SRT：人參皂苷Rg131.116 min、擬人參皂苷F1141.078 min、人參皂苷Rb142.618 min、人參皂苷Rc 43.553 min、人參皂苷Rb344.797 min、人參皂苷Rd 46.607 min。實(shí)際保留時(shí)間依次為31.628、41.036、42.828、43.663、44.757、46.451 min。單純定性條件下，滿足預(yù)測(cè)保留時(shí)間與實(shí)測(cè)保留時(shí)間的誤差應(yīng)不超過0.5 min 的要求[16]，說明該雙標(biāo)選擇在col 16 上保留時(shí)間預(yù)測(cè)效果良好。

表3 10種雙標(biāo)化合物選擇方案

2.6.3 雙標(biāo)線性校正法與相對(duì)保留時(shí)間法的對(duì)比對(duì)雙標(biāo)線性校正法與相對(duì)保留時(shí)間法在西洋參破壁飲片液相色譜中定性的優(yōu)劣進(jìn)行比較。雙標(biāo)線性校正法以色譜圖靠近兩端的人參皂苷Re和人參皂苷Rb2為雙標(biāo)化合物，相對(duì)保留時(shí)間法以人參皂苷Rb2為參照物，表4 為在15 根色譜柱上2 種方法的比較結(jié)果，與相對(duì)保留時(shí)間法比較，雙標(biāo)線性校正法的保留時(shí)間預(yù)測(cè)值的絕對(duì)偏差波動(dòng)范圍較小且絕對(duì)偏差較低。由此可見，雙標(biāo)線性校正預(yù)測(cè)保留時(shí)間的準(zhǔn)確性優(yōu)于相對(duì)保留時(shí)間。

表4 不同色譜柱2種方法不同成分保留時(shí)間預(yù)測(cè)值的絕對(duì)偏差

3 討論

3.1 檢測(cè)器的選擇

擬人參皂苷F11作為西洋參特征成分，母體結(jié)構(gòu)為奧克娣隆型化合物，在紫外區(qū)僅有末端吸收。通過比較西洋參破壁飲片的CAD 與二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)圖譜，發(fā)現(xiàn)DAD 下未見相應(yīng)峰，而CAD 下響應(yīng)較好，指紋特征性更強(qiáng)且靈敏度高，基線更平穩(wěn)。故選擇CAD 建立西洋參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜研究。

3.2 前處理及色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用HPLC 測(cè)定皂苷類成分，對(duì)水飽和正丁醇與甲醇不同溶劑、超聲與加熱回流不同提取方法及提取時(shí)間等進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，甲醇超聲30 min提取的供試品溶液色譜峰信息全面完整且操作簡(jiǎn)單，足以適用于對(duì)西洋參破壁飲片定性研究。所用流動(dòng)相有乙腈-0.01%三氟乙酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水等[17-18]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫系統(tǒng)顯示的圖譜峰形好、基線平穩(wěn)，可滿足8 個(gè)皂苷類成分的分離要求，且水相較于三氟乙酸和甲酸更安全、經(jīng)濟(jì)又方便。

本研究采用HPLC-CAD 建立西洋參破壁飲片的指紋圖譜，同時(shí)，對(duì)同批次來源的西洋參傳統(tǒng)飲片指紋圖譜的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，探究?jī)烧咧g的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)飲片與破壁飲片之間色譜峰相似度均大于0.939，各共有峰的保留時(shí)間幾乎一致。這表明，西洋參傳統(tǒng)飲片經(jīng)破壁粉碎并制成破壁飲片的過程中，化學(xué)成分無明顯變化，超微破壁粉碎技術(shù)并未造成傳統(tǒng)飲片中主成分流失及新化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化或生成[19]。筆者又結(jié)合DRS Origin 軟件對(duì)15 根色譜柱采集的西洋參破壁飲片數(shù)據(jù)擬合，進(jìn)而對(duì)色譜峰定位，確定雙標(biāo)化合物，再用雙標(biāo)線性校正預(yù)測(cè)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間。結(jié)果與相對(duì)保留時(shí)間法相比，雙標(biāo)線性校正法預(yù)測(cè)定位更準(zhǔn)確且實(shí)用方便，表明該方法在中藥復(fù)雜的多指標(biāo)成分定性方面有著很好的應(yīng)用前景。