‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交后代的表型特征及生理特性

阿 蕓， 師尚禮， 李自立， 張曉燕， 歐克杰， 周文文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

‘清水’紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Qingshui’)是我國審定登記的第一個(gè)根莖型苜蓿品種，品種登記號(hào)為412，主要生長在甘肅省清水縣和定西半陰濕的山腳地帶?！逅俎５母凳堑湫偷母o型，沒有主根，全部為水平或斜生的根莖根，根莖上長出的芽發(fā)育成新株；它的莖一般為半平臥型生長，比直根型和根蘗型的莖纖細(xì)且耐踐踏，是新型的優(yōu)質(zhì)放牧型牧草，但其產(chǎn)量較低[1-4]。目前，雜交育種是我國牧草育種中應(yīng)用最普遍、成效最好的育種方法，其具有創(chuàng)新性，能夠引起植物體遺傳變異并表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，能更快地選育出符合育種目標(biāo)，是大幅度提高苜蓿產(chǎn)量的一個(gè)重要途徑[5-7]。有學(xué)者對(duì)雜交苜蓿各性狀與其產(chǎn)量進(jìn)行相關(guān)分析研究，發(fā)現(xiàn)株高、莖粗和分枝數(shù)等與其產(chǎn)量緊密相關(guān)[8-9]。

陳立強(qiáng)、師尚禮等[10-11]研究結(jié)果表明，甘肅清水縣灌叢草原地帶的野生紫花苜蓿與栽培品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，還通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)野生紫花苜蓿較栽培品種表現(xiàn)出了相對(duì)獨(dú)立的遺傳特性；張雪婷等[12]研究結(jié)果顯示，隴東野生紫花苜蓿的核型為2B型，染色體較不對(duì)稱，屬較為進(jìn)化的核型；南麗麗等[13-15]研究表明，根莖型‘清水’的抗寒性強(qiáng)于根蘗型‘甘農(nóng)2號(hào)’和直根型‘隴東’，且其抗旱性中等。以上研究為‘清水’苜蓿雜交優(yōu)勢開發(fā)提供了依據(jù)。因此，本試驗(yàn)以‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交后代選育系RSA-01，RSA-02和RSA-03為研究對(duì)象，于種植第5年對(duì)雜交材料的形態(tài)特征和生理特性進(jìn)行觀測分析，進(jìn)一步了解其表型性狀形態(tài)變異特征，并采用相關(guān)性和通徑分析，了解其地上生物量與形態(tài)的關(guān)系，為后期提高根莖型苜蓿產(chǎn)量改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2020年在甘肅省蘭州市甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗(yàn)站進(jìn)行，研究區(qū)位于蘭州市西北部，地處黃土高原西端(105°41′ E，34°05′ N)，海拔1 525 m，屬溫帶半干旱大陸性氣候，年均氣溫9.7℃，平均年降水量451.6 mm，年蒸發(fā)量1 664 mm。試驗(yàn)地地勢平坦，土壤類型為黃綿土，土層較薄，通氣好。

1.2 試驗(yàn)材料

本研究以‘清水’紫花苜蓿與‘WL168’紫花苜蓿的雜交材料RSA-01，RSA-02和RSA-03及其親本為試驗(yàn)材料。

2002年，研究團(tuán)隊(duì)在甘肅清水縣灌叢草原地帶發(fā)現(xiàn)了野生紫花苜蓿，挖取其單株移栽于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州安寧牧草試驗(yàn)站進(jìn)行分株繁殖和馴化栽培。2005年，選取莖枝較為直立、植株較高、葉量大、分枝多的根莖單株與直根型‘WL168’進(jìn)行人工雜交，以根莖型根系和地上生物量為目標(biāo)性狀進(jìn)行后代選育，2005年秋分株收獲雜交種子。2006～2007年采用集團(tuán)選擇法進(jìn)行選擇，獲得地上生物量較高的根莖枝條直立型紫花(RSA-01)單株12個(gè)，根莖枝條半平臥型紫花(RSA-02)單株10個(gè)，根莖枝條平臥型紫花(RSA-03)單株12株。2008～2010年，采用集團(tuán)內(nèi)混合選擇法選擇符合目標(biāo)性狀的株系組。2012～2013年按品系分別進(jìn)行種植，進(jìn)行品系群體內(nèi)開放傳粉、分系收種，獲得雜交材料RSA-01，RSA-02和RSA-03，其株型特點(diǎn)如下。

RSA-01：莖枝與地面夾角70～80°、絕對(duì)株高較高、葉量較大。

RSA-02：莖枝與地面夾角30～69°、絕對(duì)株高較高、葉量較大。

RSA-03：莖枝與地面夾角30°以下、絕對(duì)株高較高、葉量大。

‘WL168’苜蓿購自北京正道生態(tài)科技有限公司，其它材料均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

前人研究表明，在半干旱地區(qū)，苜蓿生長最佳的利用年限為5～6年[16-17]，因此，本試驗(yàn)選取了種植第5年的苜蓿為研究對(duì)象，在第三茬初花期進(jìn)行試驗(yàn)。2016年4月23日進(jìn)行播種，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共5個(gè)處理(3個(gè)雜交材料、2個(gè)親本材料)，每個(gè)處理3次重復(fù)，小區(qū)面積為3 m×5 m，行距為30 cm，播量為1 g·m-2。

1.4 指標(biāo)測定及方法

1.4.1形態(tài)指標(biāo)測定 地上生物量[18](t·hm-2)：每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取1 m2樣地，齊地刈割后稱重，重復(fù)3次，取其平均值。

株高[18](cm)：每個(gè)小區(qū)隨機(jī)測定10株，測量其絕對(duì)株高(地面至最高處垂直距離)，求其平均值。

莖粗[18](mm)：每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取10株，用游標(biāo)卡尺測量選定單株主莖距地面5 cm處主莖的直徑，求其平均值。

莖葉比[18]：每個(gè)小區(qū)取500 g鮮草，將莖葉分離后稱重，放入105℃烘箱內(nèi)殺青10 min，65℃烘干至恒重，計(jì)算莖葉比，重復(fù)3次，取其平均值。

葉長(cm)、葉寬(cm)和葉面積(cm2)[19]：每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取10株，用葉面積儀測定，求其平均值，葉片均取于第三葉位之三出復(fù)葉。

1.4.2生理指標(biāo)測定 過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性參考Chance等方法測定[20]。3 mL的反應(yīng)體系包括：100 mM PBS(pH=6.0)，20 mM愈創(chuàng)木酚和40 mM H2O2。測定時(shí)，先將2.9 mL的反應(yīng)混合液在25℃水浴中預(yù)熱5 min，然后加入100 μL酶液啟動(dòng)反應(yīng)，在470 nm波長下測定單位時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性參考Giannopolitis等方法測定[21]，稍有改動(dòng)。3 mL的反應(yīng)體系包括：2.8 mL反應(yīng)混合液[50 mM PBS(內(nèi)含0.1 mM EDTA，13 mM甲硫氨酸和75 μM NBT，pH=7.8)]，100 μL酶液和100 μL核黃素溶液，于560 nm波長下測定吸光值。

過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用稍作修改的Havir等的方法測定[22]。測定時(shí)，取2.9 mL的反應(yīng)混合液(50 mM PBS，內(nèi)含0.1 mM EDTA，pH=7.8)，加入50 μL酶液，在25℃下水浴中預(yù)熱5 min，然后加入50 μL的19 mM H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，在240 nm波長下測定單位時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析方法

式中X為測定指標(biāo)具體數(shù)值，N為重復(fù)數(shù),Xi第i個(gè)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交材料的地上生物量

RSA-01，RSA-02地上生物量與‘清水’無顯著差異，而RSA-03地上生物量比‘清水’高24.72%(P<0.05)。RSA-01和RSA-02地上生物量分別比‘WL168’低24.90%和18.30%(P<0.05)，而RSA-03地上生物量與‘WL168’差異不顯著。

圖1 ‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交材料較親本的地上生物量差異Fig.1 Above-ground biomass difference between the hybrid material of ‘Qingshui’ and ‘WL168’compared to their parents注：圖中不同小寫字母表示不同材料間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different materials at the 0.05 level

2.2 雜交材料形態(tài)特征

RSA-01，RSA-02和RSA-03莖粗均顯著高于‘清水’(P<0.05)(表1)；RSA-02，RSA-03莖粗均顯著高于‘WL168’ (P<0.05)，而RSA-01與‘WL168’無顯著性差異。RSA-02，RSA-03莖葉比均顯著低于‘清水’，而RSA-01與‘清水’差異不顯著；RSA-01，RSA-02和RSA-03莖葉比與‘WL168’均無顯著性差異。5個(gè)處理的株高、葉長、葉寬和葉面積差異均不顯著。

表1 ‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交材料較親本的形態(tài)特征差異Table 1 Differences in morphological characteristics between the hybrid materials of ‘Qingshui’alfalfa and ‘WL168’compared to their parents

由表2可知，雜交材料各表型性狀變異豐富，其指標(biāo)的變異系數(shù)大小順序?yàn)椋喝~面積(10.91%)>莖葉比(9.47%)>株高(8.67%)>葉長(7.71%)>葉寬(7.61%)>莖粗(5.06%)，莖粗變異系數(shù)最小，說明莖粗表現(xiàn)最整齊。雜交材料莖粗變異系數(shù)低于親本材料，兩者莖粗范圍分別為2.54～2.64 mm和2.19～2.50 mm。不同雜交材料莖粗變異系數(shù)大小順序?yàn)椋篟SA-02(7.87%)>RSA-01(5.15%)>RSA-03(2.17%)，說明RSA-03表現(xiàn)最整齊。

表2 供試材料各形態(tài)指標(biāo)的變異系數(shù)Table 2 Variation coefficient of each morphological index about all test materials

2.3 雜交材料生理特性

不同雜交材料的抗氧化酶(POD，SOD和CAT)活性與‘清水’和‘WL168’比較(表3)，RSA-01，RSA-02和RSA-03 POD活性均顯著低于‘清水’(P<0.05)；RSA-01和RSA-03 POD活性均顯著低于‘WL168’(P<0.05)，而RSA-02與‘WL168’差異不顯著。RSA-01，RSA-03 SOD活性與‘清水’和‘WL168’均無顯著性差異，而RSA-02顯著低于‘清水’和‘WL168’。RSA-01，RSA-03與‘清水’的CAT活性差異均不顯著，而RSA-02 CAT活性比‘清水’低54.86%(P<0.05)；RSA-01和RSA-02 CAT活性分別比‘WL168’低29.80%，61.71%(P<0.05)，而RSA-03 CAT活性與‘WL168’差異不顯著。

表3 ‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交材料較親本生理特性差異Table 3 Differences in physiological characteristics between the hybrid materials of ‘Qingshui’ alfalfa and ‘WL168’compared to their parents

2.4 不同雜交材料地上生物量與形態(tài)指標(biāo)的相關(guān)分析

如表4所示，RSA-01地上生物量與其形態(tài)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)大小依次為：莖葉比>株高>莖粗>葉長>葉面積>葉寬，地上生物量與莖葉比呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與株高呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。RSA-02地上生物量與其形態(tài)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)大小依次為：莖葉比>株高>莖粗>葉長>葉寬>葉面積，與莖葉比呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，而與株高、莖粗分別呈極顯著關(guān)系(P<0.01)和顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。RSA-03地上生物量與其形態(tài)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)大小依次為：莖葉比>株高>葉面積>莖粗>葉長>葉寬，地上生物量與莖葉比呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與株高呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表4 不同雜交材料地上生物量與形態(tài)指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlation between above-ground biomass and morphological indices of different hybrid materials

2.5 不同雜交材料形態(tài)指標(biāo)對(duì)地上生物量的通徑分析

地上生物量在一定程度上反映產(chǎn)量的高低，本研究在相關(guān)分析的基礎(chǔ)上，通過通徑分析，探討RSA-01，RSA-02和RSA-03的各形態(tài)指標(biāo)對(duì)其地上生物量的作用大小(表5)。

表5 不同雜交材料形態(tài)指標(biāo)與地上生物量的通徑分析Table 5 Path analysis of morphological indexes and above-ground biomass of different hybrid materials

RSA-01形態(tài)指標(biāo)對(duì)其地上生物量的直接通徑系數(shù)大小依次為：莖粗>莖葉比>葉長>株高>葉面積>葉寬，莖粗對(duì)其地上生物量的直接效應(yīng)最大，其次是莖葉比。RSA-02形態(tài)指標(biāo)對(duì)其地上生物量的直接作用大小依次為：莖葉比>莖粗>株高>葉寬>葉面積>葉長，莖葉比對(duì)其地上生物量的作用最大，其次是莖粗，而株高通過莖葉比對(duì)地上生物量的間接效應(yīng)較大(I. E.= 0.682)。RSA-03形態(tài)指標(biāo)對(duì)其地上生物量的直接通徑系數(shù)大小依次為：莖葉比>株高>葉寬>葉長>葉面積>莖粗，莖葉比對(duì)其地上生物量的直接作用最大，而株高通過莖葉比對(duì)地上生物量的間接效應(yīng)較大(I.E.=0.760)。

3 討論

產(chǎn)量是苜蓿育種過程中的主要選育和評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，而地上生物量在一定程度上反映產(chǎn)量的高低，其中，產(chǎn)量性狀的形態(tài)指標(biāo)包括了株高、莖粗、莖葉比和葉面積等[23-25]。變異系數(shù)是反映遺傳變異占均值的大小，可以衡量不同變量的變異程度[26-27]，對(duì)雜交材料優(yōu)勢表現(xiàn)和潛力開發(fā)的研究具有重要的意義。本研究RSA-03地上生物量顯著高于‘清水’，RSA-03莖粗顯著高于‘WL168’和‘清水’，且其莖粗變異系數(shù)最小，為2.17%。所以，RSA-03的地上生物量、莖粗具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，且其莖粗表現(xiàn)最整齊，這為后期高產(chǎn)根莖型苜蓿材料的篩選奠定了理論基礎(chǔ)。

植物體內(nèi)的SOD，POD和CAT等是清除活性氧的清除劑，是抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，對(duì)逆境非常敏感[28-29]。植物衰老程度越高，清除活性氧的能力越弱[30]。通常，通過植物地上部分的生長情況及抗逆性指標(biāo)(SOD，CAT，POD活性和丙二醛含量)來直接或間接的反應(yīng)植物對(duì)某環(huán)境的適應(yīng)能力[30-31]。本研究中，RSA-01，RSA-03的POD活性顯著低于兩個(gè)親本，RSA-02的POD活性顯著低于‘清水’；RSA-02的SOD和CAT活性顯著低于兩個(gè)親本，RSA-01的CAT活性顯著低于‘WL168’，表明各雜交材料抗氧化酶活性的雜交優(yōu)勢值較親本低，一方面說明了各雜交材料的衰老程度可能比雙親快，另一方面間接體現(xiàn)了雜交苜蓿對(duì)移栽環(huán)境適應(yīng)能力較低，這可能與材料來源、選育、移栽和生長環(huán)境等有關(guān)[29-30]。

產(chǎn)量構(gòu)成要素是決定豆科牧草生物量的重要因素，有學(xué)者對(duì)不同苜蓿材料形態(tài)特征與產(chǎn)量進(jìn)行相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)苜蓿株高、莖粗與其產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[25,32-35]；張帆等[36]通過對(duì)紫花苜蓿雜交群體產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳分析，發(fā)現(xiàn)株高、分枝數(shù)、莖葉比為干重主要構(gòu)成因素，莖粗主要是通過間接作用影響干重。本研究應(yīng)用相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)地上生物量與株高、莖葉比顯著相關(guān)(P<0.05)，這與前人研究結(jié)果相似[31-34,36]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過通徑分析表明，RSA-01，RSA-02和RSA-03莖葉比、莖粗與地上生物量的D.E.分別為-0.649和0.709，-0.700和0.422，-0.858和0.189。在其它形態(tài)指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定的情況下，莖葉比每減少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，地上生物量就相應(yīng)得到提高，而莖粗每增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位時(shí)，地上生物量得到提高。莖葉比、莖粗是影響地上生物量的關(guān)鍵因素，而其它因素也是高產(chǎn)育種過程中不可忽視的重要因素[37]。

4 結(jié)論

與‘清水’相比，RSA-03的地上生物量和莖粗都具有顯著的雜種優(yōu)勢，但其抗逆性減弱。通徑分析表明，莖葉比、莖粗是影響地上生物量的關(guān)鍵因素。該結(jié)果為紫花苜蓿后期產(chǎn)量改良及抗逆性研究提供理論依據(jù)。