加工與貯藏條件對偃松種鱗精油抑菌活性和功能穩(wěn)定性的影響1)

禚宇 孫文婕 李德海 蔣沙沙 祝清超

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (內(nèi)蒙古森工集團(tuán)阿龍山森工公司苗圃)

偃松(Pinuspumila)是松科(Pinaceae Spreng. ex F. Rudolphi)松屬(PinusLinn)常綠灌木，又名馬尾松、五針?biāo)杉叭毡臼?，廣泛分布在中國東北、俄羅斯遠(yuǎn)東、日本和朝鮮半島[1]。偃松種子、芽、枝條、針葉、根部等，在東北亞民間藥物中被用于治療神經(jīng)痛、皮膚病、風(fēng)濕病、黃癬、關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核等疾病[2]。偃松的果實(shí)可食用，含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、多酚等生物活性物質(zhì)[3]，是健身、健腦、滋補(bǔ)的良品[4]。偃松種鱗作為松仁的加工副產(chǎn)物，資源豐富，而且含有大量的揮發(fā)性精油，具有抑菌、抗氧化功能。但是，偃松種鱗精油易揮發(fā)、不穩(wěn)定，導(dǎo)致加工利用率較低，不僅浪費(fèi)生物資源，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。

植物精油作為一種天然活性物質(zhì)，具有良好的抗氧化、抑菌活性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品添加劑、化妝品等領(lǐng)域[5]。然而，由于精油的易揮發(fā)性、物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、熱降解等缺點(diǎn)，使其在加工貯藏過程中容易受到環(huán)境因素的影響，從而降低生物活性[6]。溫度、光照對精油香氣成分含量和組分含量均存在不同程度影響，芳樟醇對溫度、光照敏感度較低，在高溫時(shí)，含量會有小幅度下降[7]；香茅醇、酯類、金合歡醇、烷烴類含量，在常溫時(shí)變化趨勢不明顯，在高溫時(shí)變化較大[8]。pH值低的環(huán)境，會使精油中酚類化合物所帶的羥基的電離度下降，疏水性增加，更容易和細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，提高抑菌活性[9]。水分含量高、貯藏溫度高、光照的條件時(shí)，精油更容易酸敗，造成精油質(zhì)量下降，從而對香味成分的穩(wěn)定性、貯藏性造成不良影響；采用密封、避光、低溫的條件，更加有利于精油香味成分的貯藏，使其發(fā)揮更好的功效[10-11]。但是，目前關(guān)于加工與貯藏條件對偃松種鱗精油抑菌功能穩(wěn)定性的研究較少。

本研究以偃松種鱗為試驗(yàn)材料，采用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取精油；以大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)4種常見腐敗菌為供試菌，以抑菌圈直徑、最低抑菌濃度、最低殺菌濃度為評價(jià)指標(biāo)，分析熱、酸堿性、光照、金屬離子和殼聚糖等處理?xiàng)l件對偃松種鱗精油抑菌活性和功能穩(wěn)定性的影響。旨在為探索偃松種鱗精油的最佳加工和貯藏條件，避免精油在此過程的損失提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

偃松種鱗，于2020年11月份采自內(nèi)蒙古阿龍山林業(yè)局，將其晾干后用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩(孔徑0.3 mm)，密封儲存?zhèn)溆?；NaCl、CaCl2、FeCl3、FeCl2、KCl，固體，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉，均采購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；二甲基亞砜(DMSO)，購自南通潤豐石油化工有限公司；殼聚糖，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)，供試菌種均來源于東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

主要儀器：Clevenger 精油提取裝置(蒸餾瓶3 L，訂制)；DS—T100 型高速多功能粉碎機(jī)(上海市頂帥工貿(mào)有限公司)；LT502E 型電子天平(常熟市天量儀器有限責(zé)任公司)；EL20 型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市塞得利實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠)。

1.2 偃松種鱗精油的提取

采用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法[12]提取精油。稱取偃松種鱗粉末200 g，置于3 000 mL的圓底燒瓶中，按m(種鱗)∶V(蒸餾水)為1 g∶8 mL的比例加入1 600 mL蒸餾水，同時(shí)加入8 g NaCl2，攪拌均勻后浸泡3 h。預(yù)處理完成后，連接Clevenger裝置進(jìn)行水蒸氣蒸餾8 h；待裝置冷卻后，將得到的精油用無水硫酸鈉干燥后，溶于滅菌后的二甲基亞砜溶液(體積分?jǐn)?shù)為5%)中配制成體積分?jǐn)?shù)為50%的精油溶液，4 ℃密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 加工貯存條件

溫度設(shè)計(jì)：將體積分?jǐn)?shù)為50%的精油溶液，在4 ℃分別放置0、1、2、3、6、9、12、15 d；另取一定量的精油，在25、60、80 ℃，分別處理0、30、60、90、120、150、180 min。

pH設(shè)計(jì)：將體積分?jǐn)?shù)為50%的精油溶液，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaOH溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的檸檬酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10；同時(shí)將無菌水調(diào)至不同pH值作為對照組。

紫外線照射設(shè)計(jì)：將體積分?jǐn)?shù)為50%的精油溶液放置在紫外燈下(功率20 W，垂直距離35 cm)，分別照射30、60、90、120、150 min；對照組不進(jìn)行處理。

金屬離子溶液配制：用體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜溶液，分別配制質(zhì)量濃度為25 g/L的CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液；取2.5 mL精油、一定量的上述離子溶液均置于5 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜溶液定容，使得CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液的最終質(zhì)量濃度均為5、10、15、20、25 g/L；以同質(zhì)量濃度不含偃松種鱗精油的CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液為對照組。

殼聚糖溶液配制：取適量殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液，用體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜溶液定容后，配制成質(zhì)量濃度為25 g/L的殼聚糖溶液；取2.5 mL精油、一定量的上述殼聚糖溶液均置于5 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜溶液定容，使得殼聚糖溶液的最終質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25 g/L；以同質(zhì)量濃度不含偃松種鱗精油的殼聚糖溶液為對照組。

1.4 精油抑菌活性測定

菌懸液的制備：取出-80 ℃甘油凍藏的不同菌種，解凍后，將其接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行2～3次活化后，從斜面培養(yǎng)基上挑取1環(huán)菌體接種到液體培養(yǎng)基中，放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)至菌體的對數(shù)生長期后，采用平板計(jì)數(shù)法將菌懸液濃度調(diào)至106～107個(gè)/mL。

偃松種鱗精油抑菌圈直徑測定：采用濾紙片法[13]對偃松種鱗精油的抑菌活性進(jìn)行測定。無菌環(huán)境中，用移液槍取100 μL菌懸液置于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，涂布均勻后制成含菌平板，每個(gè)平板均勻放置3片直徑為6 mm的濾紙片(濾紙片均已滅菌)。每片濾紙上滴加10 μL體積分?jǐn)?shù)為50%的偃松種鱗精油溶液，用體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜溶液作為對照。將培養(yǎng)皿用封口膜密封后，倒放在恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

最低抑菌體積分?jǐn)?shù)、最低殺菌體積分?jǐn)?shù)的測定：采用倍比稀釋法[14]，測定偃松種鱗精油對4種供試菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)、最低殺菌體積分?jǐn)?shù)。取10支試管(編號1～10)——1號試管中，加入5 mL液體培養(yǎng)基，為空白；9號試管中，加入4 mL液體培養(yǎng)基、1 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜溶液、100 μL菌懸液；10號試管中，加入5 mL培養(yǎng)基與100 μL菌懸液，為陰性對照；2～8號試管中，加入100 μL菌懸液，再依次加入1 mL由體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜溶液稀釋的不同體積分?jǐn)?shù)的偃松種鱗精油溶液(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 mL/L，再加入4 mL液體培養(yǎng)基。將10支試管置于37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，分別取這4種菌懸液100 μL于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察4種菌的生長情況。以無細(xì)菌生長的平板所對應(yīng)的精油體積分?jǐn)?shù)，為精油對該細(xì)菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)。

將上述平板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。以無細(xì)菌生長的平板所對應(yīng)的精油體積分?jǐn)?shù)，為精油對該細(xì)菌的最低殺菌體積分?jǐn)?shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，所有數(shù)據(jù)利用Excel 2019、SPSS 21.0、Origin 8.0統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行數(shù)據(jù)方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 偃松種鱗精油的抑菌活性

精油抑菌圈直徑：通過測量抑菌圈直徑的大小，定性評價(jià)偃松種鱗精油對不同菌種的抑菌活性(見圖1)。由表1可見：偃松種鱗精油對4種供試菌均有一定的抑菌效果，其抑菌活性，由大到小依次為大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。對大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌效果，好于對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果。革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上存在差異；革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁比較薄，交聯(lián)松散，使得精油中的活性物質(zhì)更容易經(jīng)過細(xì)胞壁，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，并進(jìn)一步影響細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)；因此，偃松種鱗精油對革蘭氏陰性菌的抑菌活性，高于對革蘭氏陽性菌的抑菌效果。

圖1 偃松種鱗精油對4種供試菌的抑菌圈直徑

表1 偃松種鱗精油對不同菌種的抑菌活性

最低抑菌體積分?jǐn)?shù)(MIC)、最低殺菌體積分?jǐn)?shù)(MBC)：通過最低抑菌體積分?jǐn)?shù)、最低殺菌體積分?jǐn)?shù)對4種供試菌的抑菌效果進(jìn)行定量分析表明(見表2)，不同的菌種對精油的敏感程度不同，最低抑菌體積分?jǐn)?shù)、最低殺菌體積分?jǐn)?shù)也不同。偃松種鱗精油，對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌4種供試菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)，分別為5.000、10.000、20.000、20.000 mL/L；對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌4種供試菌的最低殺菌體積分?jǐn)?shù)，分別為10.000、20.000、40.000、40.000 mL/L。由此可見，少量的偃松種鱗精油便可抑制細(xì)菌的生長，實(shí)際應(yīng)用成本比較低。

表2 偃松種鱗精油對4種供試菌的抑菌效果

2.2 溫度對精油抑菌活性的影響

由表3可見：在4 ℃貯藏精油，隨時(shí)間的增加4種供試菌的抑菌圈直徑基本無變化。因此，認(rèn)為精油在4 ℃可以長期存放，且穩(wěn)定性較好。由表4可見：25 ℃時(shí)，隨時(shí)間的增加抑菌圈直徑基本不變，精油的抑菌活性穩(wěn)定；在60、80 ℃時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長，精油對4種供試菌的抑菌圈直徑明顯降低，因此，可以認(rèn)為精油的貯藏溫度越高其抑菌的效果越差。這表明，精油中所包含的抑菌物質(zhì)，在高溫條件時(shí)揮發(fā)或者失去活性，從而影響了精油對細(xì)菌的抑制作用。因此，在精油的加工、應(yīng)用過程中，應(yīng)將溫度控制在室溫條件下，以避免高溫導(dǎo)致精油的抑菌活性降低。

表3 4 ℃時(shí)不同處理時(shí)間的精油抑菌穩(wěn)定性

2.3 pH對精油抑菌活性的影響

由表5可見：精油對大腸桿菌的抑菌圈直徑，從pH=3的(14.25±0.14)mm逐漸降低到pH=10的(10.85±0.13)mm；精油對其他菌種的抑菌圈直徑，也隨著pH的增大逐漸降低；可以看出，隨著pH的增大，偃松種鱗精油的抑菌活性逐漸降低。借鑒文獻(xiàn)[15]并結(jié)合本研究結(jié)果，認(rèn)為造成這一現(xiàn)象的原因主要是，細(xì)菌在酸性環(huán)境中自身的活性降低，使得精油可以更好地抑制其生長；其次，pH的降低，會減小精油活性成分上所帶有的羥基的電離度，疏水性增加，使精油與細(xì)菌菌體的細(xì)胞膜及其脂蛋白的結(jié)合變得更加容易，進(jìn)一步提高了抑菌活性。

表4 25、60、80 ℃時(shí)不同處理時(shí)間的精油抑菌穩(wěn)定性

表5 不同pH時(shí)的精油抑菌穩(wěn)定性

2.4 紫外照射對精油抑菌活性的影響

由表6可見：隨著紫外線照射時(shí)間的不斷延長，偃松種鱗精油對4種不同供試菌的抑菌效果基本沒有變化，保持了良好的穩(wěn)定性；該結(jié)果與艾薇等[16]研究一致。主要是因?yàn)?，精油中所含的成分多為醇類、烯萜類物質(zhì)，這些物質(zhì)都對紫外線有較好的穩(wěn)定性，在紫外線照射時(shí)不會發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變，因此精油在紫外線的照射下抑菌活性保持穩(wěn)定。

2.5 金屬離子對精油抑菌穩(wěn)定性的影響

由表7可見：金屬離子Ca2+、Fe3+、Fe2+、K+對4種供試菌均有一定的抑菌效果，但抑菌效果不顯著。由表8可見：添加不同的金屬離子溶液后，精油對4種供試菌的抑菌圈直徑，隨著金屬離子質(zhì)量濃度的增大而增大，抑菌效果明顯增強(qiáng)。借鑒文獻(xiàn)[17]并結(jié)合本研究結(jié)果，認(rèn)為金屬離子靠近細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，會破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，從而使細(xì)菌失去繁殖能力，導(dǎo)致死亡；當(dāng)金屬離子與精油結(jié)合使用時(shí)，金屬離子破壞細(xì)胞膜，使得精油更容易與細(xì)菌結(jié)合，加速細(xì)菌細(xì)胞凋亡，提升了精油的抑菌效果。

表6 紫外線照射時(shí)間不同時(shí)的精油抑菌穩(wěn)定性

2.6 殼聚糖對精油抑菌活性的影響

由表9可見：殼聚糖本身具有一定的抑菌活性，且隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增大，活性增強(qiáng)。加入殼聚糖后，偃松種鱗精油溶液對4種供試菌的抑菌圈直徑明顯增大。目前，殼聚糖多是采用制備復(fù)合膜以及微膠囊與精油結(jié)合，以提高精油的穩(wěn)定性和抑菌活性，使其更好地應(yīng)用在果蔬及肉制品保鮮中[18-19]；本研究結(jié)果表明，當(dāng)殼聚糖與偃松種鱗精油結(jié)合使用時(shí)，抑菌效果會得到提升，這也為精油的進(jìn)一步應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

表7 金屬離子對4種供試菌的抑菌效果

表8 添加不同質(zhì)量濃度金屬離子的精油抑菌效果

表9 殼聚糖及其對精油的抑菌效果

3 結(jié)論

偃松種鱗精油對4種供試菌的生長，均有一定的抑制作用，其抑菌活性，由大到小依次為大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌；由于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組成成分不同，導(dǎo)致其對革蘭氏陰性菌的抑制作用大于對革蘭氏陽性菌的作用。

抑菌穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，偃松種鱗精油對紫外線有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

在酸性環(huán)境中，偃松種鱗精油的抑菌活性提高；而在堿性環(huán)境中，精油的抑菌效果下降。

在4、25 ℃時(shí)，偃松種鱗精油有較好的抑菌穩(wěn)定性；而在60、80 ℃時(shí)，偃松種鱗精油抑菌活性會隨著時(shí)間的延長而下降。殼聚糖、金屬離子的添加，都會使偃松種鱗精油的抑菌效果有所提升。本研究為偃松種鱗精油的貯藏加工與應(yīng)用提供了技術(shù)參考，有利于偃松種鱗精油的進(jìn)一步開發(fā)與利用。