隴南野生中華獼猴桃組培快繁體系的建立

陳強(qiáng) 田鳳鳴 何九軍 王永斌 劉瓊

摘要：以隴南野生中華獼猴桃種子為材料，在無菌條件下培養(yǎng)萌發(fā)產(chǎn)生實(shí)生苗，將無菌實(shí)生苗地上部分轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上建立的初代培養(yǎng)體系為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)繼代增殖最適培養(yǎng)條件為：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+GA3 0.2 mg/L，生根培養(yǎng)最適條件為1/2 MS+IBA 0.6 mg/L;用商品基質(zhì)在溫室移栽組培苗，成活率可達(dá)87.5%。

關(guān)鍵詞：野生中華獼猴桃;無菌實(shí)生苗;組織培養(yǎng);快繁體系

中圖分類號：S663.4;Q943.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號：1001-1463（2021）10-0035-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.10.009

Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System of Wild Kiwifruit in Southern Gansu Province

CHEN Qiang 1， 2， TIAN Fengming 1， 2， HE Jiujun 1， 2， WANG Yongbin 1， 2， LIU Qiong 1

（1. College of Life Science，Longnan Teacher College， Longnan Gansu 742500， China; 2. Center for Research and Development of Longnan Characteristic Agro-Bioresource， Longnan Gansu 742500， China）

Abstract：The seeds of Actinidia chinensis var. Longnan were used as explants to produce seedlings under aseptic conditions. Based on the primary culture system established by transferring the above ground part of aseptic seedlings to the medium， it was found that the optimum conditions for subculture and multiplication were MS+6-BA 2.5 mg/L + NAA 0.4 mg/L+GA3 0.2 mg/L， and the optimum conditions for rooting culture were 1/2 MS+IBA 0.6 mg/L， The survival rate of tissue culture seedlings can reach 87.5% by transplanting in greenhouse with commercial substrate.

Key words：Wild kiwifruit; Aseptic seedling; Rapid propagation system

獼猴桃俗稱陽桃、山洋桃、毛桃等，屬獼猴桃科獼猴桃屬多年生藤本植物。獼猴桃果實(shí)質(zhì)地柔軟、風(fēng)味獨(dú)特，味道鮮美， 是一種營養(yǎng)豐富的保健型水果[1 - 2 ]，富含維生素C、膳食纖維和多種礦物質(zhì)元素[3 - 5 ]。獼猴桃原產(chǎn)于我國，隴南所產(chǎn)為中華獼猴桃，康縣，文縣、武都區(qū)、成縣等地均有分布[6 ]。

野生中華獼猴桃的生存狀況堪憂，這對其資源的保存和快繁提出了更高的要求。目前最常用的繁殖方式中，嫁接繁殖由于砧木質(zhì)量不一，增大了獼猴桃潰瘍病的感染率。獼猴桃潰瘍病由細(xì)菌引起，病因多種，難以控制[7 - 8 ];而扦插繁殖生根較難，成活率低，中華獼猴桃生根率僅為28.3% [9 - 10 ];植物組織培養(yǎng)具有周期短、繁殖系數(shù)高、苗木一致性高等優(yōu)點(diǎn)[11 ]，且可克服有性繁殖造成的品種退化等問題，已成為植物大量快繁和保存的首選方法[12 ]。在外植體選擇上，不同的研究者提出了可行的材料，獼猴桃種子體積小，數(shù)量多，以種子為外植體在無菌條件下操作方便，不受季節(jié)限制[13 ]，易于觀察植株生長發(fā)育狀態(tài)，短期內(nèi)可快速獲得大量無菌苗[14 ]，有利于獼猴桃實(shí)生再生體系建立和種質(zhì)快繁[15 ]。尤其在砧木的選育中，選擇種子作為外植體，能夠從豐富的變異中篩選較為優(yōu)秀、脫毒效果較好且質(zhì)量均一的砧木苗。我們以隴南野生中華獼猴桃種子為材料，在無菌條件下培養(yǎng)實(shí)生苗，將無菌實(shí)生苗地上部分轉(zhuǎn)接進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，然后用商品基質(zhì)在溫室移栽組培苗，建成了適合隴南地區(qū)的野生中華獼猴桃的組織培養(yǎng)快繁體系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 外植體的建立

供試外植體材料為野生中華獼猴桃 （Actinidia lindl. sp.）種子，來源于甘肅省隴南市文縣。采集完全成熟的獼猴桃果實(shí)，取出種子用自來水沖洗干凈，置培養(yǎng)皿中自然陰干。將經(jīng)過無菌處理后的種子接入培養(yǎng)皿的雙層濾紙上，用封口膜包好，放入培養(yǎng)室（溫度25 ℃±2 ℃，相對濕度50%）在暗光無菌條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)[16 ]。選擇生長良好、無雜菌感染初代培養(yǎng)幼苗莖尖和或腋芽，作為繼代增殖培養(yǎng)的材料備用[16 ]。

1.2 ? 試驗(yàn)方法

1.2.1 ? 繼代增殖培養(yǎng) ? 參考趙許朋等[12 ]的方法，略作修改。增殖培養(yǎng)基共設(shè)7個植物生長調(diào)節(jié)劑組合處理，分別為S1（CK）、S2、S3、S4、S5、S6、S7（表1），選取長度為0.8 cm左右的再生芽，轉(zhuǎn)移至芽增殖培養(yǎng)基，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖芽數(shù)并計(jì)算增殖倍數(shù)。

1.2.2 ? 生根培養(yǎng) ? 參考趙許朋等[12 ]的方法，略作修改。共設(shè)6個4 -吲哚- 3 -基丁酸（IBA）濃度處理，分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L（表2），其中對照為加入等量無菌蒸餾水。選取長2～3 cm的不定芽，接種至含有不同濃度IBA的1/2MS （大量元素減半）固體培養(yǎng)基中，35 d后統(tǒng)計(jì)生根率和平均生根數(shù)（根總數(shù)/接種芽數(shù)）。

1.2.3 ? 培養(yǎng)條件 ? 繼代增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)均在無菌條件下進(jìn)行，基本培養(yǎng)基為MS（由杭州木木生物科技有限公司提供），生根培養(yǎng)為1/2MS（含瓊脂8 g/L、蔗糖30 g/L，pH 5.85），溫度（25±2） ℃，光照4 500 mol/（m·s），光周期設(shè)定光照14 h，黑暗10 h。培養(yǎng)基的植物調(diào)節(jié)劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.4 ? 煉苗移栽 ? 在室溫20 ℃下控制空氣濕度在80%以上，將培養(yǎng)瓶瓶蓋擰松或棉塞拔開放置2 d，直接敞口1/3放置2 d，直接敞口1/2放置2 d，完全敞口放置1 d。將組培苗取出，清洗培養(yǎng)基，使用商品基質(zhì)移栽，適量澆水，在溫室條件下培養(yǎng)進(jìn)行生長觀察20 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合處理對獼猴桃不定芽的增殖的影響

在接種24 d后，S5 培養(yǎng)基上獼猴桃不定芽的增殖效果顯著地高于其他處理。NAA濃度為0.2、0.4 mg/L時，增殖倍數(shù)總體較對照有所增加，除S3處理與對照增加不顯著外，其余處理均較對照顯著增加。不同6-BA濃度處理的增殖倍數(shù)除S3處理與對照增加不顯著外，其余處理均較對照增加顯著。可見，在7個組合處理中，添加6-BA的濃度較大時，不定芽的增殖倍數(shù)有不同程度的減少，而過高的NAA濃度卻不會出現(xiàn)類似情況（表1）。

2.2 ? 植物生長調(diào)節(jié)劑IBA對獼猴桃生根的影響

4-吲哚-3-基丁酸（IBA）可由莖、葉吸收，移動性很小，但生物活性較為持久，其作用類似內(nèi)源生長素，誘發(fā)產(chǎn)生不定根[17 ]。從表2可以看出，中華野生獼猴桃不定芽的生根率及平均生根數(shù)，并沒有隨著IBA濃度的升高而呈現(xiàn)出一直升高的趨勢，而是呈現(xiàn)先增后減趨勢。在過高IBA濃度（1.0 mg/L）下的生根表現(xiàn)僅優(yōu)于G1處理（CK）和G2處理，且差異不顯著。G3、G4、G5處理均較G1處理（CK）和G2處理差異顯著，其中以G4處理（IBA濃度0.6 mg/L）生根情況最優(yōu)，生根率最高，為90%;平均生根數(shù)最多，為4.82條/芽，與其余處理均差異顯著。因此，生根培養(yǎng)時，應(yīng)當(dāng)選擇IBA的最佳濃度為0.6 mg/L。從表2還可以看出，沒有加入IBA的G1處理（CK）生根時間均較其余處理有所延長。

2.3 ? ?移栽成活率

野生中華獼猴桃組培苗完成煉苗并洗干凈根部的培養(yǎng)基殘留，使用商品基質(zhì)將組培苗移栽到種植盆中，并澆透水，置于智能溫室中培育。移栽2 d后，澆少量的MS營養(yǎng)液（去除蔗糖和瓊脂），20 d后統(tǒng)計(jì)成活率時發(fā)現(xiàn)，移栽的24株野生中華獼猴桃組培苗植株中，成活21株，死亡3株，成活率達(dá)87.5%，效果較好。

3 ? 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，以隴南野生中華獼猴桃種子為材料，在無菌條件下培養(yǎng)萌發(fā)產(chǎn)生實(shí)生苗，將無菌實(shí)生苗地上部分轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)繼代增殖最適培養(yǎng)條件為：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+GA3 0.2 mg/L，最適生根培養(yǎng)條件為1/2 MS+IBA 0.6 mg/L，用商品基質(zhì)在溫室移栽野生中華獼猴桃組培苗，成活率可達(dá)87.5%。

從野生資源的獲取來說，野生中華獼猴桃比較易于收集的就是種子，而且不是破壞性取樣，這是選擇種子作為外植體來源的原因之一。另外，獼猴桃莖、葉片均被有絨毛，在外植體的消毒中很難到達(dá)良好的效果，因此從種子開始培養(yǎng)獲得外植體，建立初代培養(yǎng)體系是比較好的選擇。

研究顯示，培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比是獼猴桃組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因子之一[18 ]。王林青[19 ]以3個品種的獼猴桃頂芽、帶芽莖段為外植體研究時發(fā)現(xiàn)，在NAA為0.1 mg/L 時萌芽率最高;6-BA濃度過低會抑制芽的生長，過高則愈傷組織增多，出苗率不高。薛蓮等[18 ]的研究發(fā)現(xiàn)，添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA時增殖系數(shù)較高，植株生長健壯;若6-BA濃度過高，植株基部愈傷組織膨大，并伴有褐變及玻璃化現(xiàn)象。本研究顯示，6-BA的濃度不宜過高，在NAA濃度0.4 mg/L（較高水平）、6-BA濃度2.5 mg/L、GA3濃度0.2 mg/L的條件下，野生中華獼猴桃繼代增殖效果比較明顯，與其余組合處理之間差異顯著，且獼猴桃試管苗也生長良好，葉片正常。

在野生獼猴桃的生根培養(yǎng)中，于非[20 ]研究發(fā)現(xiàn)，野生軟棗獼猴桃組培苗生根培養(yǎng)基的IBA濃度在0.2～0.5 mg/L時生根效果最好，IBA濃度為1.0 mg/L生根率下降到50%。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IBA濃度為0.6 mg/L時，隴南野生中華獼猴桃有最高的生根率，為90%，且平均生根數(shù)也最多，達(dá)到了4.82條，這基本和于非[20 ]的結(jié)論相符，而且不同IBA濃度設(shè)定更加能發(fā)映出IBA濃度對生根效果的影響。

研究中我們還發(fā)現(xiàn)，野生中華獼猴桃種子量過多時發(fā)芽率較低，這可能與封口后影響了種子的呼吸作用有關(guān)[14 ]，需要進(jìn)一步研究。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）

收稿日期：2021 - 07 - 19;修訂日期：2021 - 08 - 15

基金項(xiàng)目：隴南市科技指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目“隴南野生獼猴桃組培快繁體系的建立”（2019-ZD-17）。

作者簡介：陳 ? 強(qiáng)（1986 — ），男，甘肅隴西人，講師，研究方向?yàn)橹参锟旆斌w系。聯(lián)系電話：（0）18219892104。