MITF基因在瓦登伯格綜合征Ⅱ型中的突變分析

郭 青, 劉夢(mèng)瀟, 李志祥, 張玉婷,儲(chǔ)九圣, 孔旭輝, 龐秀紅

(1. 揚(yáng)州大學(xué)附屬泰州市人民醫(yī)院 耳鼻咽喉-頭頸外科, 江蘇 泰州, 225300;2. 揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000; 3. 大連醫(yī)科大學(xué), 遼寧 大連, 116000)

瓦登伯格綜合征(WS)是一種常染色體顯性遺傳綜合征性耳聾，感音神經(jīng)性聾及色素異常為其特征性表型[1]。該病的主要發(fā)病機(jī)制為來源于神經(jīng)嵴的黑色素細(xì)胞缺失，進(jìn)而引起一系列的相應(yīng)癥狀[2]。WS發(fā)病率在全部耳聾中占0.9%～2.8%, 在先天性耳聾中占2%～5%[1]。根據(jù)是否伴有額外的臨床表型, WS可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型4種亞型[3-4]。Ⅰ型和Ⅱ型最為常見[5-6], Ⅱ型患者內(nèi)眥間距正常[7], 臨床通常采用W指數(shù)鑒別Ⅰ型和Ⅱ型(W指數(shù)≥1.95為Ⅰ型, W指數(shù)<1.95為Ⅱ型)[8]。Ⅲ型除了具有Ⅰ型表型外，還常伴有肌肉骨胳系統(tǒng)異常，如上肢骨胳肌肉發(fā)育不良或上臂畸形等。Ⅳ型除了具有Ⅱ型表型外，還伴有先天性巨結(jié)腸病(HD)[9]或慢性假性腸梗阻[10]。

迄今為止，臨床研究[11]已報(bào)道6個(gè)基因與WS相關(guān)，分別為SOX10、SNAI2、PAX3、MITF、EDNRB和EDN3 。其中,MITF基因(NM_000 248.4)全稱為小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，含有9個(gè)高度保守的外顯子。約15%的WS Ⅱ型由MITF基因突變引起[11], 這些突變主要集中在MITF基因的6～9號(hào)外顯子之間，對(duì)應(yīng)于MITF蛋白的bHLH-Zip結(jié)構(gòu)域。近年來，相關(guān)研究[12-14]發(fā)現(xiàn)MITF基因純合突變還可能分別與多發(fā)性原發(fā)性黑色素瘤和WS Ⅳ型相關(guān)。因此,MITF基因的基因型和表型異質(zhì)性高，有待進(jìn)一步探索。本課題組前期收集到1例疑似WS家系成員樣本，并擬用遺傳性疾病常用檢查手段探尋該家系遺傳性病因，旨在通過遺傳咨詢及婚育指導(dǎo)實(shí)現(xiàn)耳聾的一級(jí)預(yù)防。

1 資料與方法

1.1 病例資料

本研究納入WS家系由江蘇省泰州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科門診招募，共三代5名家系成員(漢族)，其中患者3名(Ⅲ-1、Ⅱ-2、Ⅰ-2)，正常家系成員2名(Ⅱ-1和Ⅰ-1)。征得家系成員同意并簽署知情同意書(未成年人由其法定監(jiān)護(hù)人代理)后，研究人員對(duì)該家系成員進(jìn)行詳細(xì)病史詢問及體格檢查，繪制家系圖，采集靜脈全血樣本。本研究獲得泰州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基宣言》。

詳細(xì)詢問家系成員病史，排除外傷、中耳炎、耳毒性藥物等因素導(dǎo)致的耳聾或者伴有其他特殊臨床表型的綜合征性遺傳性耳聾，如Pendred綜合征、Alport綜合征、Usher綜合征等。對(duì)所有家系成員進(jìn)行耳科、眼科、毛發(fā)、皮膚色素、腹部、肌肉骨骼和四肢關(guān)節(jié)等全面體格檢查，并行智力評(píng)估。采用聽力學(xué)檢查方法評(píng)估聽力損傷程度，包括電測(cè)聽、聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射、多重聽覺穩(wěn)態(tài)誘發(fā)反應(yīng)測(cè)驗(yàn)等。采用影像學(xué)檢查方法如內(nèi)耳核磁共振(MRI)評(píng)估家系成員是否有內(nèi)耳畸形，同時(shí)特別關(guān)注毛發(fā)、虹膜及皮膚色素的變化，以及與WS相關(guān)的其他發(fā)育缺陷(如內(nèi)眥外移、肢體畸形、胃腸道癥狀等)。測(cè)量相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)算并比較家系成員的W指數(shù)[8]。W指數(shù)計(jì)算方法: 測(cè)量?jī)?nèi)眥間距(A)、雙瞳間距(B)、外眥間距(C), W指數(shù)=(2A-0.211 9C-3.909)/C +(2A-0.247 9B-3.909)/B+A/B, 其中W指數(shù)≥1.95表示內(nèi)眥外移。本研究涉及到的全部檢查均在江蘇省泰州市人民醫(yī)院相應(yīng)科室中由?？漆t(yī)生完成。

1.2 方法

1.2.1 采集靜脈血抽提DNA: 抽取家系成員外周靜脈血2 mL, 采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的離心柱型血液全基因組DNA抽提試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit: DP318-03)提取基因組DNA, 使用核酸檢測(cè)儀(Thermo NANODROP 2000)對(duì)DNA原液進(jìn)行定量和純度分析, -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 3大常見耳聾基因全序列篩查:GJB2、SLC26A4、MT-RNR1基因引物序列及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[15]。

1.2.3 WS相關(guān)候選基因全序列篩查:PAX3、MITF、SNAI2、EDN3、EDNRB和SOX10基因擴(kuò)增引物參考相關(guān)研究[5]。所有PCR反應(yīng)均在ABI2720熱循環(huán)儀上完成，上述基因的第1輪和第2輪PCR擴(kuò)增條件相同，即95 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸35 s, 變性、退火和延伸3個(gè)步驟重復(fù)35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min, PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。將通過凝膠電泳鑒定合格的巢式PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序，并采用Sequencher 5.4.6軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.4 家系內(nèi)驗(yàn)證: 利用家系成員樣本對(duì)可疑突變進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，以尋找基因型-表型共分離位點(diǎn)。

1.2.5 評(píng)估可疑突變可能的致病效應(yīng): 利用Exome Variant Server、ExAC Browser、Mutation Taster、Polyphen-2、PROVEAN(閾值<1.3)和SIFT(閾值<0.05)等軟件評(píng)估可疑錯(cuò)義突變位點(diǎn)進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)。

1.2.6 遺傳咨詢和婚育指導(dǎo): WS主要為常染色體顯性遺傳，找到該家系遺傳學(xué)病因后，根據(jù)孟德爾遺傳定律，對(duì)該家系成員進(jìn)行遺傳咨詢和婚育指導(dǎo)。

2 結(jié) 果

2.1 臨床結(jié)果

該家系所有成員無慢性中耳炎、耳外傷等病史和耳毒性藥物使用史。先證者(Ⅲ-1)表現(xiàn)為雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聾、日益增多的面部暗褐色斑點(diǎn)和偶發(fā)便秘。先證者母親(Ⅱ-2)表現(xiàn)為右側(cè)極重度感音神經(jīng)性聾、早白發(fā)、偶發(fā)便秘和面部、全身大量暗褐色斑點(diǎn)。先證者外婆(Ⅰ-2)表現(xiàn)為雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聾、雙側(cè)虹膜異色、早白發(fā)、面部及全身大量暗褐色斑點(diǎn)、腸道功能紊亂。先證者已適齡行右側(cè)人工耳蝸植入，日常生活中交流基本正常。先證者、先證者母親及先證者外婆的W指數(shù)均<1.95, 視力和智力正常，無其他系統(tǒng)異常。見圖1、2。

2.2 突變分析

3大常見耳聾基因GJB2、SLC26A4、MT-RNR1全序列篩查未見致病突變。WS相關(guān)候選基因PAX3、MITF、SNAI2、EDN3、EDNRB、SOX10全序列篩查發(fā)現(xiàn)MITF基因第8個(gè)外顯子發(fā)生雜合突變c.C763T(p.R255X), 見圖3。該突變第763編碼堿基C變?yōu)門, 導(dǎo)致第255個(gè)編碼精氨酸的密碼子變成終止密碼子, MITF蛋白于255位點(diǎn)終止編碼。家系內(nèi)成員樣本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該突變?cè)诩蚁祪?nèi)呈基因型-表型共分離，即患病的先證者(Ⅲ-1)、先證者母親(Ⅱ-2)及先證者外婆(Ⅰ-2)均攜帶該突變，而未患病的家系成員則未攜帶。

3 討 論

本研究篩查所發(fā)現(xiàn)MITF基因截短突變p.R255X為既往研究[16]已報(bào)道的突變。該研究[16]報(bào)道，患病家系成員Ⅱ-7表現(xiàn)為雙側(cè)完全虹膜異色、左耳中度感音神經(jīng)性聾、右耳重度感音神經(jīng)性聾以及面部、軀干、四肢大量雀斑, Ⅲ-21表現(xiàn)為雙眼部分虹膜異色、左耳重度感音神經(jīng)性聾以及面部、軀干、四肢大量棕色雀斑, Ⅳ-15表現(xiàn)為雙眼藍(lán)色虹膜、雙耳重度感音神經(jīng)性聾，而面部、軀干和四肢未見雀斑。盡管該家系內(nèi)患病成員基因型一致，但表型卻不盡相同。CHEN H等[17]報(bào)道的p.R255X突變相關(guān)WS Ⅱ型家系中, Ⅳ-16僅表現(xiàn)為單眼部分虹膜異色; Ⅳ-15表現(xiàn)為先天性極重度感音神經(jīng)性聾及單眼部分虹膜異色; Ⅲ-20除了左耳中度感音神經(jīng)性耳聾和面部、肢體棕褐色雀斑以外，還在10歲后逐漸出現(xiàn)單側(cè)部分虹膜異色; Ⅱ-12、Ⅱ-3、Ⅱ-7及Ⅲ-10均在30歲前出現(xiàn)白發(fā)和面部、肢體雀斑; Ⅰ-2表現(xiàn)為早白發(fā)、面部雀斑。該家系同樣體現(xiàn)出該突變表型的異質(zhì)性極大。本研究家系內(nèi)患者的表型各異，更加證實(shí)了既往研究提出的MITF基因突變表型異質(zhì)性大的研究結(jié)論。

人類MITF基因定位于3p12～p14區(qū)間[18-19], 編碼螺旋-環(huán)-螺旋堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子[20], 通過bHLH-Zi結(jié)構(gòu)域從而形成同源或異源二聚體，與DNA結(jié)合進(jìn)而參與多種生長(zhǎng)發(fā)育過程的調(diào)控，尤其是黑色素細(xì)胞的存活、增殖和分化。MITF基因在神經(jīng)嵴來源的黑素細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的發(fā)育中起關(guān)鍵作用[21-23], 其構(gòu)建了調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路之間的聯(lián)系，包括PAX3和SOX10[24-25]。因此，黑色素細(xì)胞缺乏將會(huì)影響皮膚、頭發(fā)、眼睛的色素形成以及耳蝸的聽覺功能。本研究發(fā)現(xiàn)，該家系MITF基因第8個(gè)外顯子雜合突變c.C763T(p.R255X), 使編碼精氨酸密碼子變成終止密碼子，蛋白編碼提前終止。MITF蛋白單倍體劑量不足使其與DNA結(jié)合數(shù)量減少，從而轉(zhuǎn)錄激活色素基因能力下降，導(dǎo)致耳聾、早白發(fā)、色素斑點(diǎn)等色素異常臨床表型[26-28], 因此，該突變致病機(jī)制很可能與單倍體劑量不足相關(guān)。

本研究利用Sanger測(cè)序?qū)?個(gè)WS候選基因(PAX3、MITF、SNAI2、EDN3、EDNRB和SOX10)進(jìn)行全序列篩查，需要擴(kuò)增的片段只有39個(gè), 2～3 d便可以出具結(jié)果，相對(duì)于二代測(cè)序來說，其準(zhǔn)確、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)。因此，對(duì)于具有典型WS表型的家系來說，對(duì)候選基因進(jìn)行一代測(cè)序篩查是性價(jià)比最高的首選策略。

WS為常染色體顯性遺傳，患者后代有50%概率患病，因此明確患者家系的遺傳學(xué)病因?qū)樵摷蚁档漠a(chǎn)前診斷提供理論依據(jù)。本研究篩查發(fā)現(xiàn),MITF基因p.R255X在家系中呈基因型-表型共分離，結(jié)合既往研究中對(duì)該位點(diǎn)致病性的報(bào)道分析，該突變很可能為本研究該家系遺傳性致病因素。給予遺傳咨詢及婚育指導(dǎo)，應(yīng)用羊水穿刺、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷及胚胎植入前診斷等技術(shù)，可以避免該家系后代因?yàn)樵撐稽c(diǎn)致聾，從而實(shí)現(xiàn)耳聾的一級(jí)預(yù)防。

綜上所述,MITF基因p.R255X截短突變很可能為本研究WS家系的遺傳性致病因素。遺傳咨詢、婚育指導(dǎo)和羊水穿刺、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷及胚胎植入前診斷等技術(shù)的應(yīng)用，可以實(shí)現(xiàn)該位點(diǎn)所致耳聾的一級(jí)預(yù)防。