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    一例早發(fā)性卵巢功能不全患者的ATG7新發(fā)變異分析

    2021-10-23 06:07:06尚凌月王穎忱張曉金吳燕華
    關(guān)鍵詞:錯(cuò)義遺傳變異卵母細(xì)胞

    尚凌月,楊 熙,王穎忱,張 鋒,3,張曉金,3,吳燕華,4

    (1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200433; 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院,上海 200011; 3. 上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200011; 4. 生物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(復(fù)旦大學(xué)),上海 200433)

    早發(fā)性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency, POI),是一種常見的女性生殖系統(tǒng)疾病,指女性40歲以前出現(xiàn)卵巢功能減退,主要表現(xiàn)為閉經(jīng)或者月經(jīng)稀發(fā),促性腺激素水平升高和雌激素水平下降[1],還常伴有不同程度的潮熱盜汗、煩躁易怒等圍絕經(jīng)期癥狀.

    既往研究發(fā)現(xiàn),40歲以前的女性中約有1%面臨POI的困擾[2].由于卵巢功能過早衰竭,POI患者不僅面臨生育困境,還會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性的多種全身性慢性疾病[3].POI的病因十分復(fù)雜,且大部分POI患者病因尚未明確,病毒感染、醫(yī)源性損傷(如手術(shù)、放療化療等)、藥物影響、自身免疫缺陷、環(huán)境因素以及遺傳因素等,都可能導(dǎo)致POI.以往的臨床研究發(fā)現(xiàn),遺傳致病因素占POI病因的20%~25%,在POI的病因?qū)W研究中占有重要地位[4].

    已有的POI遺傳病因研究揭示了一些可能致病的核型異常以及單基因變異.例如,目前普遍認(rèn)為染色體異常是POI的常見病因,包括X染色體數(shù)量異常、X染色體結(jié)構(gòu)異常、常染色體結(jié)構(gòu)異常[3].又如,脆性X綜合征相關(guān)致病基因FMR1前突變提高POI致病風(fēng)險(xiǎn)[4-7].已報(bào)道的可導(dǎo)致POI的單基因遺傳變異涉及約60余個(gè)基因,患者表型包括綜合征型的POI和非綜合征型POI.例如BLM[5],CLPP[6-7],F(xiàn)OXL2[8]等基因的純合致病變異可導(dǎo)致綜合征型POI,除了POI表型外,患者可伴有生長(zhǎng)遲緩和胰島素抵抗、聽力受損、或者眼瞼發(fā)育不良等癥狀.又如減數(shù)分裂相關(guān)基因DMC1[9],MCM8[10-11]等的純合致病變異,DNA修復(fù)相關(guān)基因FANCL[12]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因FIGLA[13]等的單等位基因致病變異會(huì)導(dǎo)致非綜合征型POI.

    全外顯子組測(cè)序(Whole-Exome Sequencing, WES)技術(shù)是一種新穎的高通量二代測(cè)序技術(shù),適用于篩選孟德爾疾病及罕見綜合征的致病基因.近年來WES在POI的遺傳病因分析中也發(fā)揮了重要作用.利用WES技術(shù),在POI家系以及散發(fā)患者中已經(jīng)鑒定出多個(gè)新穎的POI致病基因,例如STAG3,SYCE1,SPIDR,HFM1等[2].但是目前臨床上仍有半數(shù)以上的POI患者病因不明.

    本研究利用WES技術(shù)以及遺傳分析在中國(guó)漢族POI患者隊(duì)列中篩查候選致病變異,發(fā)現(xiàn)了一例攜帶ATG7c.1372G>A(p.V458M)突變的患者.由以往研究可知,ATG7基因缺陷與POI表型關(guān)系密切[14-15],提示本研究發(fā)現(xiàn)的ATG7新發(fā)突變很有可能是該P(yáng)OI患者的病因.本研究進(jìn)一步通過Sanger測(cè)序、家系回訪和生物信息學(xué)分析等方法深入探究了該突變致病的可能性.

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    本研究的研究對(duì)象由復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院收集.入組POI患者的標(biāo)準(zhǔn)是: (1) 年齡小于40歲的女性出現(xiàn)≥4個(gè)月的月經(jīng)稀發(fā)或者閉經(jīng)現(xiàn)象;(2) 至少兩次,且時(shí)間間隔>4周的血清基礎(chǔ)卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)>25 IU/L[1];(3) 無染色體變異、自身免疫病、醫(yī)源性損傷、腮腺炎病史、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素影響等.本研究通過了復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2017-19),患者在了解本研究并自愿簽署知情同意書后入組.

    1.2 基因組DNA(genome DNA, gDNA)提取

    使用QIAamp?DNA Blood Mini Kit(QIAGEN,德國(guó)),從患者的外周血中提取gDNA,之后利用Nanodrop儀器測(cè)定其濃度和純度,以及通過瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估抽提的gDNA質(zhì)量.

    1.3 WES及測(cè)序結(jié)果比對(duì)

    gDNA樣品的WES由艾吉泰康生物科技(北京)有限公司完成.以gDNA為材料構(gòu)建文庫,使用Hiseq X-Ten平臺(tái)(Illumina,美國(guó))進(jìn)行測(cè)序.在過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)后,與參考基因組GRCh37/hg19(2009)進(jìn)行比對(duì),識(shí)別遺傳變異位點(diǎn)并進(jìn)行注釋,獲得所有捕獲區(qū)域的遺傳變異信息.

    1.4 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

    篩選WES結(jié)果得到的候選遺傳變異,首先根據(jù)其在基因組上的位置,通過UCSC網(wǎng)站(https:∥genome.ucsc.edu)獲取其上下游序列,以之為模板設(shè)計(jì)引物,引物應(yīng)能擴(kuò)增出包含待驗(yàn)證變異位點(diǎn)在內(nèi)的、長(zhǎng)度在200~1 000 bp之間的PCR產(chǎn)物.引物正向序列為ATGTCTCTGTTTGCTGCCCT,反向序列為TGGCACTATGCTACCAGGTC.使用Golden Star T6 Super PCR Mix(擎科,中國(guó))試劑,通過PCR擴(kuò)增目的片段.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen,美國(guó))凝膠回收PCR產(chǎn)物,隨后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序,并使用SnapGene軟件查看分析測(cè)序結(jié)果.

    1.5 生物信息學(xué)分析

    利用SWISS -MODEL網(wǎng)站[16](https:∥swissmodel.expasy.org)模擬蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu).利用PSIPRED網(wǎng)站[17](http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/introduction/)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu).

    2 結(jié) 果

    2.1 POI患者的臨床病理信息

    本研究的POI患者1997年出生,初潮年齡是12歲,初潮后的幾年月經(jīng)規(guī)律,月經(jīng)周期為28~31 d,經(jīng)期4 d,經(jīng)量偏少.患者從2016年開始出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)的情況,無其他既往病史,2018年7月27日測(cè)得FSH水平為86.51 IU/L,2018年10月12日測(cè)得FSH水平為128.39 IU/L,兩次連續(xù)測(cè)量水平高于40 IU/L,被診斷為POI.2018年11月20日B超檢查其雙側(cè)卵巢偏小,且未發(fā)現(xiàn)明顯卵泡.詳細(xì)的臨床信息如表1所示.核型分析顯示患者的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)均無異常.該患者為獨(dú)生女,父母均體格健康,且母親月經(jīng)規(guī)律,目前年齡46歲,未絕經(jīng).

    表1 攜帶ATG7突變的POI患者臨床病理信息

    2.2 WES與遺傳變異分析

    從患者外周血提取的gDNA,經(jīng)Nanodrop分析,其濃度大于50 ng/μL,吸光度A260/A280在1.8~2.0之間,A260/A230>1.9,質(zhì)量較高.瓊脂糖凝膠電泳顯示gDNA的濃度和條帶大小適宜,可用于WES.

    WES測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)后,共獲得150 709個(gè)遺傳變異,包括單核苷酸變異(Single Nucleotide Variants, SNVs)和短插入缺失(Insertion-Deletion, InDel).我們?cè)O(shè)計(jì)了POI患者WES測(cè)序結(jié)果的分析流程,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估后再進(jìn)行遺傳變異篩選,表2顯示了具體的篩選流程以及每一步篩選后保留的遺傳變異數(shù).具體來說,首先對(duì)WES獲得的所有遺傳變異進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估.其次,去除位于內(nèi)含子或者距離剪切區(qū)域15 bp以外的變異.第三,因?yàn)镻OI的發(fā)病率為1%,遺傳因素占POI病因的20%~25%,且具有高度異質(zhì)性,所以本研究中最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency, MAF)篩選閾值選擇為1‰,即保留在千人基因組數(shù)據(jù)庫(1 000 Genome,1KG)[18]、ExAC和gnomAD[19]3個(gè)數(shù)據(jù)庫中東亞人群頻率均小于1‰的變異.第四,根據(jù)突變類型的不同進(jìn)行有害性評(píng)估.篩去同義SNVs;通過SIFT[20]、PolyPhen-2[21]、MutationTaster[22]、CADD[23]4種算法預(yù)測(cè)錯(cuò)義SNVs的有害性,保留4種軟件均認(rèn)為有害的SNVs;直接保留其他功能喪失型突變,包括無義突變、終止密碼子丟失、移碼或者非移碼的InDel以及剪切位點(diǎn)變異.最終得到39個(gè)候選的致病性遺傳變異(表2)及相應(yīng)基因.

    表2 WES數(shù)據(jù)篩選流程及結(jié)果

    對(duì)39個(gè)候選基因及變異進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研,包括POI患者的臨床報(bào)道、動(dòng)物模型和該基因的功能實(shí)驗(yàn),綜合評(píng)估每個(gè)遺傳變異的致病可能性.最終發(fā)現(xiàn)一個(gè)已知POI致病基因的新變異,即ATG7 c.1372G>A(p.V458M)(表3).ATG7,即自噬相關(guān)基因7(autophagy-related 7),參與細(xì)胞自噬調(diào)節(jié).已有的小鼠模型研究表明條件性敲除ATG7導(dǎo)致小鼠生育力下降[14],此外ATG7的雜合錯(cuò)義突變可能誘發(fā)POI[15].綜合前人的研究,我們認(rèn)為本研究發(fā)現(xiàn)的ATG7雜合錯(cuò)義突變很可能也是該位患者的遺傳學(xué)病因.

    表3 一例POI病人中發(fā)現(xiàn)的ATG7突變的信息

    1)ATG7的GenBank轉(zhuǎn)錄本編號(hào)是NM_006395;2) 等位基因頻率指突變的等位基因在1KG Project、ExAC和gnomAD數(shù)據(jù)庫東亞人群中的頻率;3) 利用SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和CADD 4個(gè)軟件評(píng)估突變的功能.

    2.3 ATG7雜合錯(cuò)義變異的驗(yàn)證

    為排除WES結(jié)果假陽性,我們利用Sanger測(cè)序進(jìn)行變異驗(yàn)證.針對(duì)突變位點(diǎn),我們?cè)O(shè)計(jì)了用于Sanger測(cè)序的引物,確定發(fā)現(xiàn)的ATG7的突變是真實(shí)存在的變異,測(cè)序結(jié)果如圖1(a)(見第440頁)所示.進(jìn)一步通過回訪獲得其父母樣本進(jìn)行測(cè)序,確定父母的基因型.結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者攜帶的ATG7變異是新發(fā)變異,健康父母均未攜帶該變異(圖1(b),見第440頁).根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)發(fā)布的序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)與指南[24],參考其中對(duì)于致病或可能致病的變異分類的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分,4種生物信息學(xué)功能預(yù)測(cè)軟件均預(yù)測(cè)該變異有害,該變異在東亞人群數(shù)據(jù)庫中缺失.患者攜帶的變異為新發(fā)變異,父母不攜帶該變異且表型健康,共計(jì)符合1個(gè)支持(PP3)和2個(gè)中等(PM2、PM6)的致病性證據(jù)標(biāo)準(zhǔn),該變異屬于可能致病(likely pathogenic).

    圖1 POI患者以及其父母ATG7基因型Fig.1 The ATG7 genotype of the POI proband and her pedigree(a) ATG7基因的Sanger測(cè)序.WT為野生型,M為c.1372G>A突變型,箭頭指向突變位點(diǎn).(b) POI患者家系圖.實(shí)心圓圈表示POI患者,黑色箭頭指向先證者,空心圓圈表示正常女性,空心方塊表示正常男性.

    2.4 變異位點(diǎn)的有害性分析

    我們進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)手段在蛋白質(zhì)水平評(píng)估ATG7基因c.1372G>A(p.V458M)的有害性.首先,變異改變的氨基酸位點(diǎn)在斑馬魚、雞、哺乳動(dòng)物等中均保守(圖2(a)).其次,利用SWISS -MODEL模擬構(gòu)建ATG7蛋白的三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)p.V458M變異位于其α-螺旋的位置(圖2(b));利用PSIPRED 4.0預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),p.V458M變異位于α-螺旋形成起始部位(圖2(c)),可能對(duì)于其α-螺旋的形成具有重要作用.第三,變異氨基酸位點(diǎn)同報(bào)道的POI致病性ATG7變異c.1209T>A(p.F403L)相近,都位于蛋白保守的E1-like區(qū)域(圖2(d)),該區(qū)域可能起源于古老的原核生物合成途徑,ATG7利用該區(qū)域作為支架形成同源二聚體[25-26].

    圖2 ATG7變異分析Fig.2 Genetic analysis of the ATG7 variant(a) 突變位點(diǎn)保守性分析.紅色V表示錯(cuò)義突變的位點(diǎn)所在氨基酸.(b) 突變位點(diǎn)在蛋白模型中的位置分析.紅框以及放大區(qū)域表示出突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)氨基酸所在的位置.(c) 突變所在位置的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析.紅框標(biāo)出突變所在位置.藍(lán)色方框表示預(yù)測(cè)的可信度,顏色越深可信度越高.(d) 突變位點(diǎn)所在基因組及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域位置分析.橙色箭頭指向已報(bào)道的突變位點(diǎn),藍(lán)色箭頭指向本研究所報(bào)道的突變位點(diǎn).藍(lán)色方框?yàn)榈鞍踪|(zhì)的E1-like區(qū)域,包括354~510位氨基酸.

    3 討 論

    卵巢是女性生殖系統(tǒng)的性腺,是卵細(xì)胞發(fā)育的場(chǎng)所,具有生殖和內(nèi)分泌的重要功能.人類女性在出生前后,卵巢中的每個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞均被單層扁平上皮細(xì)胞包圍,形成相互獨(dú)立的始基卵泡(primordial follicle),它們構(gòu)成了女性一生的生殖儲(chǔ)備池.進(jìn)入青春期后,每個(gè)月會(huì)有15~20個(gè)左右的始基卵泡被激活,卵母細(xì)胞重新啟動(dòng)減數(shù)分裂,優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育成熟并排卵.卵巢儲(chǔ)備池中的卵泡數(shù)量隨著女性年齡的增加而不斷下降,直至完全耗竭,女性會(huì)發(fā)生自然閉經(jīng)[27].POI嚴(yán)重影響了女性的生理周期和生育力,如果患者患病較早,甚至可能不育[28].揭示POI病因?qū)τ诒Wo(hù)女性健康,減少對(duì)生育力的威脅具有重要意義.本研究通過WES技術(shù)對(duì)POI患者的遺傳病因進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)一位攜帶ATG7基因雜合c.1372G>A(p.V458M)突變的患者.結(jié)合以往ATG7和POI的臨床報(bào)道和動(dòng)物模型研究,以及對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行一代測(cè)序和生物信息學(xué)分析后,我們認(rèn)為篩選得到的ATG7變異很可能是該患者的致病原因.

    自噬以及構(gòu)成自噬核心機(jī)制的蛋白質(zhì)成分從酵母到哺乳動(dòng)物中都是高度保守的.細(xì)胞自噬主要有3種形式: 巨自噬(macroautophagy,自噬的最主要形式,以下簡(jiǎn)稱自噬)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)[29].哺乳動(dòng)物自噬核心途徑起始于雙層膜結(jié)構(gòu)的吞噬泡的形成,至少有5組蛋白分子參與其中,包括: (1) Atg1/ULK(unc-51-like)激酶復(fù)合物;(2) Beclin1/PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)復(fù)合物;(3) 兩種跨膜蛋白Atg9和VMP1(vacuole membrane protein 1);(4) 兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng)Atg12和Atg8/LC3;(5) 介導(dǎo)自噬體和溶酶體融合的蛋白.其中Atg7參與兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng),該系統(tǒng)是吞噬泡擴(kuò)展延伸所必須的[30].Atg7是非經(jīng)典的同源二聚體E1酶(E1 enzyme),可與非經(jīng)典的E2酶Atg3相互作用,在自噬過程中介導(dǎo)泛素樣蛋白Atg8的結(jié)合從Atg7轉(zhuǎn)移到Atg3,在這個(gè)過程中Atg8依次被Atg7和Atg3激活[25,31].

    2019年,Delcour等在高加索人群散發(fā)性POI樣本中分別發(fā)現(xiàn)了自噬相關(guān)基因ATG7和ATG9A的雜合錯(cuò)義突變各1例,功能研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變導(dǎo)致了細(xì)胞自噬能力下降,是誘發(fā)POI的可能遺傳機(jī)制[15].此外,早期研究顯示一些自噬相關(guān)基因的純合缺失小鼠無法存活.例如,Atg7純合缺失的小鼠在出生后一天內(nèi)死亡[32];Beclin1純合缺失小鼠在胚胎期就已經(jīng)死亡[33].2011年Gawriluk等[34]發(fā)現(xiàn)卵巢自噬功能受損會(huì)影響卵母細(xì)胞的存活,具體表現(xiàn)為出生一天后,Beclin1雜合敲除小鼠卵巢的生殖細(xì)胞比對(duì)照組減少了56%,而Atg7純合缺失小鼠卵巢在這一時(shí)期亦沒有可辨認(rèn)的生殖細(xì)胞[34].這些工作提示了自噬基因與雌性生育力之間的潛在聯(lián)系.2015年Song等[14]在雌性小鼠的生殖細(xì)胞中特異性敲除Atg7,小鼠產(chǎn)仔數(shù)比對(duì)照組減少了約63%,并且發(fā)現(xiàn)這種小鼠第一胎可育且產(chǎn)仔數(shù)與對(duì)照組無明顯差異,但是隨后每窩產(chǎn)仔數(shù)突然減少或變得完全不育.組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn),雖然在受精后17.5天時(shí)條件性敲除Atg7小鼠與對(duì)照組的卵母細(xì)胞數(shù)量無明顯差異,但是在出生3天后觀察到卵母細(xì)胞的過度丟失,表明自噬可能是新生兒期生殖細(xì)胞存活所必需的.經(jīng)過體外模擬新生兒卵巢發(fā)育過程,該研究還表明自噬機(jī)制正確調(diào)控可減少卵巢生殖細(xì)胞過度丟失.哺乳動(dòng)物新生兒出生后即面臨嚴(yán)重的饑餓狀態(tài),此時(shí)器官會(huì)誘導(dǎo)自噬、通過自體蛋白的降解來生產(chǎn)氨基酸,以維持能量穩(wěn)態(tài)[35].在小鼠饑餓模型中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),對(duì)新生小鼠進(jìn)行饑餓處理會(huì)誘導(dǎo)卵巢中卵母細(xì)胞自噬水平上升,卵母細(xì)胞和體細(xì)胞凋亡增加,延遲始基卵泡池的建立[36].由此推測(cè),哺乳動(dòng)物出生時(shí)可能需要正常的自噬功能幫助克服早期的饑餓階段,也從而保護(hù)卵母細(xì)胞出現(xiàn)過度丟失.

    本研究發(fā)現(xiàn)的雜合ATG7變異屬于新發(fā)突變,有兩種可能的遺傳模式: 單倍體不足或者突變的顯性負(fù)作用.錯(cuò)義突變可能會(huì)影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平或mRNA穩(wěn)定性,從而導(dǎo)致單倍體不足.另一方面,因?yàn)锳TG7發(fā)揮功能需要形成同源二聚體[25-26],而p.V458M變異位于α-螺旋的關(guān)鍵位置,可能影響二聚體的形成與功能,發(fā)揮顯性負(fù)效應(yīng).進(jìn)一步的遺傳模式分析還有賴于深入的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn).

    綜上,本研究在一位中國(guó)漢族POI患者中鑒定出一個(gè)ATG7雜合錯(cuò)義變異.這是迄今為止在POI患者中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)致病性ATG7遺傳變異,再次提示了自噬對(duì)于女性卵巢儲(chǔ)備的重要性,并豐富了POI的遺傳病因.

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