人源RNA解旋酶DDX1的表達(dá)、究

高寶才，段樹(shù)燕,蘇曉琴，紀(jì) 銳，李繼喜

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438； 2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

RNA解旋酶幾乎參與RNA代謝的所有主要步驟，包括pre-mRNA剪切、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA編輯和衰減、核糖體合成[1-2].DEAD -box蛋白(DDXs)屬于RNA解旋酶超家族II，也是最大的解旋酶家族[3].DDX蛋白包含有9個(gè)保守基序，分別命名為Q、Ⅰ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ.其中基序Ⅱ也稱為Walker B基序，是以DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)氨基酸序列為特征，并在抗病毒免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著核心作用[4].DDX家族蛋白在發(fā)揮解旋酶功能時(shí)，ATP與RNA之間存在協(xié)同作用[5].目前已知有60余人源DDX蛋白，其中DDX1除了具有共有的解旋酶結(jié)構(gòu)域外，其基序Ⅰ和Ⅰa之間包含一個(gè)SPRY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白-RNA相互作用[6].

DDX1最初是在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，并在腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，因此DDX1被作為乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物和卵巢癌的預(yù)測(cè)標(biāo)志物[7].DDX1還參與多種細(xì)胞功能，例如mRNA/miRNA加工[8-9]，與hnRNP K相互作用[10]，參與NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄[11-12]，參與富含AU的元素介導(dǎo)的衰變，以及募集到含有RNA-DNA結(jié)構(gòu)的DNA損傷位點(diǎn)[13-15].此外，DDX1在病毒復(fù)制，尤其是在HIV-Rev的復(fù)制中發(fā)揮重要的作用[16]；也可與DDX21、DHX36以及接頭蛋白TRIF組成一個(gè)巨大復(fù)合物，可以感知和識(shí)別流感病毒A、呼腸孤病毒以及長(zhǎng)短鏈poly(I： C)信號(hào)，激活NF-κB和I型干擾素的表達(dá)[17].目前DDX家族中只有少數(shù)幾個(gè)成員，如DDX58(也叫RIG-I)[18]、MDA5[19]和DHX36的結(jié)構(gòu)得以解析[20].我們實(shí)驗(yàn)室最近也獲得了DDX21識(shí)別和解旋底物RNA的多個(gè)狀態(tài)的結(jié)構(gòu)信息，闡明了DDX21識(shí)別和結(jié)合流感病毒NS1蛋白的作用機(jī)理.但目前有關(guān)DDX1如何識(shí)別、結(jié)合和解旋RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)尚未報(bào)道.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析和分析對(duì)于研究其功能機(jī)制具有極為重要的意義，解析DDX1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象，將有助于我們進(jìn)一步理解其發(fā)揮解旋酶功能的機(jī)制以及在各種生理病理過(guò)程中發(fā)揮功能的分子機(jī)理.

1 材料和方法

1.1 材料和主要試劑

1.1.1 材料

各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等均購(gòu)自TaKaRa公司.E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)plysS感受態(tài)菌株購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司.pSMT3表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室?guī)齑?，其N端帶有6×His-Sumo標(biāo)簽.剪切Sumo標(biāo)簽的Ulp1酶由本實(shí)驗(yàn)室自行純化保存.

1.1.2 主要試劑

所用試劑均為分析純，大腸桿菌培養(yǎng)基，卡那霉素、氯霉素等抗生素均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，Ni-NTA親和層析柱、凝膠過(guò)濾層析柱(Superdex75 10/300 GL，Superdex75 16/600 GL，Superdex 200 10/300 GL，Superdex200 16/600 GL)均購(gòu)自GE有限公司.

1.2 方法

1.2.1 人源DDX1的克隆、表達(dá)及純化

以人源DDX1基因(NM_004939.2)為模板，設(shè)計(jì)兩端引物，采用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切(見(jiàn)表1，酶切位點(diǎn)已用下劃線標(biāo)出)，從人cDNA文庫(kù)中克隆全長(zhǎng)及不同截短體DDX1到pSMT3載體上[21].經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，并送公司測(cè)序以確定各種截短體質(zhì)粒構(gòu)建是否正確，相關(guān)信息見(jiàn)表2.

表1 引物信息

表2 人源DDX1蛋

之后將構(gòu)建好的不同表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3) plysS中.將轉(zhuǎn)化后的菌液加入到卡那霉素終濃度為50 μg/mL、氯霉素抗性終濃度為34 μg/mL的新鮮LB培養(yǎng)基(100 mL)中，于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜.第二天按1∶50的體積比將菌液接種到1 L加有卡那霉素、氯霉素的LB培養(yǎng)基中；37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，18 ℃ 誘導(dǎo)表達(dá)18～20 h.經(jīng)7 000 r/min離心20 min收集菌體，棄去上清，用Buffer(50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L Imidazole，5% glycerol，pH 8.0)進(jìn)行重懸菌體(按每克30 mL的量)，然后使用低溫超高壓細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行菌體破碎.

在4 ℃條件下，18 000 r/min離心1 h，收集破菌液上清.上清蛋白樣品用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行梯度洗脫純化(洗脫Buffer： 50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L Imidazole，5% glycerol，pH 8.0).洗脫樣品加Ulp1酶(1∶1 000)，于4 ℃過(guò)夜酶切去除N端的Sumo標(biāo)簽[22]，再進(jìn)行二次Ni-NAT親和層析.流出液(目的蛋白)通過(guò)SDS -PAGE檢測(cè)，根據(jù)蛋白純度進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析(Buffer： 20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，pH 8.0).最后將獲得的高純度蛋白收取濃縮，液氮速凍保存于-80 ℃待用.

1.2.2 動(dòng)態(tài)光散射分析

動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering， DLS)分析參考文獻(xiàn)[22]，測(cè)定儀器為動(dòng)態(tài)激光光散射儀(DynaPro NanoStar)，配套軟件為DYNAMICS.測(cè)定時(shí)，目的蛋白濃度為1 mg/mL，每組數(shù)據(jù)采集10次，每個(gè)樣品獨(dú)立測(cè)量5次(測(cè)量時(shí)蛋白Buffer： 20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，pH 8.0).

1.2.3 X射線小角散射分析

X射線小角散射(Small-Angle X-ray Scattering, SAXS)分辨率為1～25 nm，能夠直接測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)分子的輪廓和分布狀態(tài)，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及蛋白質(zhì)-核酸相互作用研究中發(fā)揮重要作用.SAXS數(shù)據(jù)在上海同步輻射光源BL19U2線站進(jìn)行收集.樣品在檢測(cè)前，需在低溫下進(jìn)行17 000 r/min離心10 min，以去除沉淀和不溶物質(zhì).樣品濃度可以設(shè)置濃度梯度，每個(gè)樣品上樣量為70 μL.數(shù)據(jù)處理軟件為ATSAS (https：∥www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/).

1.2.4 DDX1蛋白的生物信息學(xué)研究

多氨基酸序列比對(duì)： 將需要比對(duì)的目的氨基酸序列提交至網(wǎng)站(https：∥www.genome.jp/tools-bin/ clustalw)，獲得比對(duì)結(jié)果；然后將結(jié)果以及相關(guān)蛋白的PDB結(jié)構(gòu)文件提交至ESPript 3.0網(wǎng)站(http：∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)，即可獲得基于三維結(jié)構(gòu)的比對(duì)結(jié)果[23].

IUPred2有序度分析： 可以通過(guò)IUPred2(http：∥iupred2a.elte.hu)對(duì)目的蛋白進(jìn)行有序度分析，發(fā)現(xiàn)目的蛋白中潛在的無(wú)序區(qū).將人源DDX1的氨基酸序列提交，即可獲得預(yù)測(cè)的有序度分析情況.

同源建模分析： SWISS -MODEL是一種全自動(dòng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源性建模服務(wù)器，可通過(guò)ExPASy Web服務(wù)器或從DeepView程序(Swiss Pdb-Viewer)訪問(wèn).將目的蛋白的氨基酸序列輸入，待系統(tǒng)進(jìn)行識(shí)別；等成功識(shí)別完成，進(jìn)行模板尋找或者是直接的模型構(gòu)建.

2 結(jié)果與分析

2.1 人源DDX1蛋白的表達(dá)及純化

本文所表達(dá)的目的蛋白N-端均帶有6×His-Sumo標(biāo)簽.DDX1全長(zhǎng)蛋白為740aa，等電點(diǎn)為6.69.DDX1主要由N-端的解旋酶ATP結(jié)合區(qū)(Helicase ATP binding，氨基酸2-428)和C-端解旋酶區(qū)(Helicase C-terminal domain，氨基酸493-681)組成(圖1(a，b)，見(jiàn)第430頁(yè)).在共有基序I和Ia之間包含一個(gè)B30.2/SPRY結(jié)構(gòu)域(氨基酸70-247)，介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白-RNA相互作用[6].目前也有文獻(xiàn)報(bào)道DDX1的C-末端區(qū)域(氨基酸525-740)與poly(A) RNA及HNRNPK蛋白相互作用[6].經(jīng)大腸桿菌表達(dá)，通過(guò)Ni-NTA柱純化，我們發(fā)現(xiàn)除DDX1(536-631)及DDX1(525-740)外，全長(zhǎng)DDX1和其余截短體均可以獲得純度較高，性質(zhì)穩(wěn)定的蛋白(圖1(c)，見(jiàn)第430頁(yè))；進(jìn)一步經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析(Superdex200 16/600 GL)方法，我們可以獲得單一穩(wěn)定蛋白(圖2(a，b)，見(jiàn)第431頁(yè)).從分子篩圖可以看出，DDX1全長(zhǎng)蛋白主要呈現(xiàn)出一個(gè)單體峰，峰尖位置在72 mL，對(duì)應(yīng)分子量大小為82 kDa，表明DDX1主要以單體形式存在.其余截短體DDX1(1-728)、DDX1(1-448)和DDX1(1-295)均表現(xiàn)出單一峰，出峰位置與這些蛋白分子量一致(圖2(a)).DDX1(1-525)截短體在分子篩上出現(xiàn)2個(gè)峰，76 mL峰對(duì)應(yīng)于單體，而45 mL峰表明該截短體有高聚傾向.此外，截短體DDX1(536-631)和DDX1(525-740)蛋白性質(zhì)極其不穩(wěn)定，很容易發(fā)生沉淀，故而未能進(jìn)行分子篩檢測(cè).

圖1 人源DDX1蛋白結(jié)構(gòu)域及表達(dá)純化結(jié)果Fig.1 Domain schematic and the in vitro purification results of human DDX1(a) 人源DDX1結(jié)構(gòu)域示意圖.綠色區(qū)域代表Helicase ATP-binding結(jié)構(gòu)域，藍(lán)色區(qū)域代表DEAD -box，灰色區(qū)域代表無(wú)規(guī)則序列區(qū)域，SPRY結(jié)構(gòu)域用紅色表示.(b) DDX1不同截短體結(jié)構(gòu)域組成信息.(c) DDX1全長(zhǎng)及不同截短體蛋白體外表達(dá)純化結(jié)果.(d) DEAD -box蛋白解旋RNA機(jī)制模型.藍(lán)色和橙色分布代表DDX家族核心功能域D1以及D2，在沒(méi)有配體情況下，蛋白采用開(kāi)放的構(gòu)象；當(dāng)結(jié)合ATP以及RNA時(shí)，蛋白處于閉合狀態(tài)，形成ATP酶活位點(diǎn)以及RNA結(jié)合位點(diǎn).在這種狀態(tài)下，RNA發(fā)生形變.解離完成，ATP水解為ADP以及游離的磷離子.

2.2 DLS及SAXS結(jié)果分析

我們將所有純化的DDX1蛋白用DLS進(jìn)行了分析，從圖2(c～e)(見(jiàn)第431頁(yè))結(jié)果可以看到，DDX1, DDX1(1-728)、DDX1(1-525)、DDX1(1-488)以及DDX1(1-295)的粒徑均小于6 nm，相對(duì)Pd值也低于20%，所占的質(zhì)量除了DDX1(1-525)外，其余均為100%.因此，這5個(gè)蛋白在溶液中均一度良好(圖2(c～e)).同時(shí)，DDX1(536-631)和DDX1(525-740)兩個(gè)截短體的分子半徑均大于8 nm，相對(duì)應(yīng)為高聚狀態(tài)；而且二者的Pd值均大于30%，表明其分子半徑分布波動(dòng)較大，進(jìn)一步佐證了這些截短體的聚合狀態(tài)不均一.結(jié)合DLS與分子篩分析(圖2(a～e))，DDX1的全長(zhǎng)蛋白及包含N-末端的截短體比較穩(wěn)定、性質(zhì)均一；而包含C-末端的截短體蛋白容易高聚，性質(zhì)不均.這可能是DDX1的C-末端具有柔性區(qū)域，適應(yīng)于其他相互作用蛋白/核酸的結(jié)合.

圖2 人源DDX1蛋白分子篩及DLS結(jié)果Fig.2 The gel-filtration profiles and DLS results of DDX1 and its truncations(a～b)DDX1全長(zhǎng)及不同截短體蛋白的分子篩(Superdex200 16/600 GL，上面)和SDS-PAGE(下面)結(jié)果.其中L代表上樣前樣品.M代表蛋白標(biāo)準(zhǔn)品.(c～e)DDX1全長(zhǎng)以及截短體蛋白的動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果.其中(c)圖表示不同蛋白在溶液中的分子粒徑大??；(d)圖表示蛋白所占的質(zhì)量百分比；(e)圖表示不同蛋白的Pd值.

進(jìn)一步用X射線小角散射(SAXS)方法分析DDX1的溶液輪廓，結(jié)果顯示DDX1全長(zhǎng)蛋白呈現(xiàn)出較為均一的分布情況(圖3)，其完整性良好且呈單分散狀態(tài).根據(jù)P(R)值計(jì)算DDX1蛋白的最大尺寸(Dmax)和回旋半徑(Rg)分別為9.953 nm和3.752 nm(圖3).

圖3 人源DDX1全長(zhǎng)蛋白SAXS數(shù)據(jù)分析Fig.3 The SAXS results of human DDX1 protein(a) 通過(guò)SAXS獲得的強(qiáng)度曲線.(b) P(R)曲線函數(shù).DDX1蛋白最大尺寸(Dmax)和回旋半徑(Rg)分別為9.953 nm和3.752 nm.

2.3 DDX1與同源家族解旋酶的多序列比對(duì)

在同源家族多重氨基酸序列比對(duì)中，選擇與人源DDX1蛋白相似度較高且有結(jié)構(gòu)報(bào)道的嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus10)來(lái)源CshA蛋白(PDB_ID： 5IVL，相似度29%，Positive： 48%)為DDX1蛋白結(jié)構(gòu)模板，分別與人源DDX21(NC_000010.11)，DDX3X(NC_000023.11,相似度29%，Positives： 46%)，IF4A3(NC_000017.11，相似度28%，Positives： 46%)以及DDX56(NC_000007.14，相似度27%，Positives： 41%)進(jìn)行多重序列比對(duì).通過(guò)比對(duì)結(jié)果可知，DDX1蛋白具有典型的DEAD -box家族特征，包含一個(gè)典型DEAD氨基酸序列，且在多個(gè)位點(diǎn)上表現(xiàn)出相同性和一致性.此外，DEAD -box家族在進(jìn)化上具有一定的保守性.除去典型的DEAD序列，其他如74-LVVAPTRELA-83，182-SAT-184以及324-YVHRUGRTGRA-334等序列片段也呈現(xiàn)出高度保守性(見(jiàn)圖4).

圖4 DDX1蛋白與DEAD -box家族蛋白的多重氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of DDX1 with its homologous proteins所比對(duì)的蛋白序列分別來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌CshA蛋白(PDB_ID： 5IVL)，人源DDX21，DDX3X，IF4A3以及DDX56.相同和高度保守的氨基酸殘基分別用紅色和白色表示.

通過(guò)Blastp在線程序?qū)Σ煌锓N來(lái)源的DDX1進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DDX1在高等哺乳動(dòng)物中具有高度的保守性；人源DDX1與蘇門(mén)答臘猩猩源蛋白具有99.86%的同源性，與小鼠源蛋白具有98%的同源性，與牛源蛋白具有97.28%的同源性.

2.4 人源DDX1蛋白的有序度分析

IUPred2是目前較為廣泛使用的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)有序度的服務(wù)器[24].將人源DDX1蛋白提交網(wǎng)站進(jìn)行計(jì)算.當(dāng)IUPred2以及ANCHOR2的評(píng)分結(jié)果高于0.5時(shí)，代表其處于無(wú)序狀態(tài)的可能性較大；分值越高，無(wú)序程度越高.從圖5可知，人源DDX1蛋白整體得分情況較低，多數(shù)氨基酸位點(diǎn)得分在0.5以下.在IUPred2的評(píng)分結(jié)果中，氨基酸序列為75-80，277-280，441-445，466-481，554-558的片段，得分處于0.5以上；而ANCHOR2評(píng)分均低于0.5，這表明DDX1蛋白整體有序度較高，不存在較長(zhǎng)片段的無(wú)規(guī)則序列卷曲.DDX1蛋白無(wú)序度最高的區(qū)域處于兩個(gè)主要功能結(jié)構(gòu)域之間，表明這些柔性區(qū)可能不利于蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)，這也與我們實(shí)驗(yàn)室最近報(bào)道的DDX21結(jié)構(gòu)類似[20].

圖5 人源DDX1蛋白的IUPred2預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 IUPred2 prediction result of human DDX1圖中紅線表示通過(guò)IUPred2對(duì)不同氨基酸的評(píng)分結(jié)果.橫坐標(biāo)表示氨基酸位點(diǎn)，縱坐標(biāo)表示分值；其中分值大于0.5的區(qū)域代表無(wú)序或者柔性區(qū).

2.5 人源DDX1蛋白的同源建模

我們將獲得的全長(zhǎng)DDX1蛋白及多個(gè)截短體蛋白進(jìn)行了1 000多個(gè)晶體條件篩選，嘗試了在不同溫度下生長(zhǎng)不同濃度的蛋白.遺憾的是，目前尚未能獲得足夠用于X射線衍射的蛋白晶體.由于DDX1與已報(bào)道的嗜熱脂肪芽孢桿菌CshA蛋白結(jié)構(gòu)具有29%的相似性[25]，我們采用SWISS -MODEL[26]進(jìn)行同源建模，以期獲得DDX1的可能結(jié)構(gòu)信息.提交人源DDX1蛋白后，我們獲得了以嗜熱脂肪芽孢桿菌CshA蛋白(PDB_ID： 5IVL)為模板的三維結(jié)構(gòu)模型.模型與模板之間的序列相似度在34.88%，且整體序列覆蓋率在90%，GMQE評(píng)分為0.34，整體可信度較高.通過(guò)PyMOL軟件(https：∥pymol.org/2/)顯示(圖6)，DDX1氨基酸序列為248-644，其余區(qū)域并沒(méi)有建模成功.所獲得的結(jié)構(gòu)模型表明，DDX1由兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域組成.其中氨基酸序列248-430為區(qū)域1，即N端解旋酶ATP結(jié)合區(qū)域，包括7個(gè)α螺旋，7個(gè)β折疊；氨基酸序列481-644為區(qū)域2，主要包括C端解旋酶區(qū)域，含6個(gè)α螺旋，7個(gè)β折疊(圖6).兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均呈現(xiàn)出典型的α/β/α亞結(jié)構(gòu)域特征，即β折疊被α螺旋所包裹.兩大核心區(qū)域之間有一段較長(zhǎng)的無(wú)規(guī)則序列卷曲(431-481)，與IUPred2分析結(jié)果中無(wú)序區(qū)域(441-445，466-481)一致.

圖6 人源DDX1蛋白三維結(jié)構(gòu)模型Fig.6 The structural model of human DDX1DDX1模型結(jié)構(gòu)由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括15個(gè)α螺旋和14個(gè)β折疊.右圖為旋轉(zhuǎn)180°的視野圖.紫色代表β折疊，天藍(lán)色代表α螺旋，黃色代表無(wú)規(guī)則序列卷曲.

3 討 論

DDX1作為RNA解旋酶DEAD -box家族中重要的一員，其在RNA代謝方面發(fā)揮著極其重要的作用[11].此外，DDX1與病毒復(fù)制及核酸代謝相關(guān)[27-28].有研究表明，DDX1可被劫持作為細(xì)胞輔因子參與冠狀病毒[28]、丙型肝炎病毒[29-30]以及人類多瘤病毒的復(fù)制[31].DDX1也在HIV病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮功能[32]，可結(jié)合HIV的Rev蛋白和RRE RNA，并具有RRE-RNA依賴的催化活性[33-34].本研究通過(guò)對(duì)不同功能區(qū)的截短體進(jìn)行表達(dá)純化以及DLS分析，發(fā)現(xiàn)涉及N端解旋酶ATP結(jié)合區(qū)域的截短體其穩(wěn)定性普遍較好，蛋白聚合狀態(tài)均一且多為單體存在.其中截短體1-295性質(zhì)最穩(wěn)定，與前人報(bào)道的DDX1蛋白以及SPRY結(jié)構(gòu)域蛋白相似[35].DDX21的C端截短體性質(zhì)不同，蛋白穩(wěn)定性差，容易發(fā)生沉淀，不利于后期晶體生長(zhǎng)(圖2).多重序列比對(duì)結(jié)果表明，DDX1具有保守的DEAD序列，其中74-LVVAPTRELA-83，182-SAT-184及324-YVHRUGRTGRA-334等片段也呈現(xiàn)出高度保守性，這表明DEAD -box家族在進(jìn)化上具有一定的保守性，保守位點(diǎn)可能對(duì)其功能發(fā)揮產(chǎn)生作用(圖4).IUPred2分析顯示氨基酸序列75-80，277-280，441-445，466-481，554-558片段的無(wú)序度較高(圖5)；SWISS -MODEL建模則表明兩大核心區(qū)域呈現(xiàn)出α/β/α折疊狀態(tài).這種“sandwich conformation”結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的DDX1蛋白SPRY結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出一致性[35].兩大核心區(qū)域之間有一段較長(zhǎng)的無(wú)規(guī)則序列卷曲(431-481)，結(jié)合IUPred2分析推測(cè)氨基酸序列(441-445，466-481)在DDX1的正確折疊中起到負(fù)面作用，不利于晶體的生成.這也提示今后的研究中，可以嘗試將這部分序列進(jìn)行相應(yīng)的處理，或許可以獲得穩(wěn)定性更高，聚合狀態(tài)更加均一的DDX1蛋白.DDX21與ssRNA的復(fù)合物結(jié)構(gòu)(PDB_ID： 6L5N)呈現(xiàn)出典型的結(jié)合模型[36]，即經(jīng)典的DEAD -box RNA解旋酶在結(jié)合ssRNA時(shí)，其解旋酶核心的兩個(gè)RecA與功能區(qū)域(D1，D2)進(jìn)行結(jié)合，形成ATPase酶活功能結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)合的裂縫.并且通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在DDX21發(fā)揮解旋酶作用時(shí)，ATP和RNA協(xié)同發(fā)揮結(jié)合作用，這與之前報(bào)道的DDX1蛋白的功能研究結(jié)論相類似[34]，推測(cè)ssRNA以及ATP/ADP對(duì)DDX1的功能發(fā)揮起到重要作用，也可能對(duì)于其結(jié)晶起到一定作用，值得進(jìn)一步嘗試.