基于雙相動(dòng)力學(xué)分析靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞SNU-387 增殖的影響及其作用機(jī)制

劉暢，裴晉紅，穆秀麗，于保鋒

1.長治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西長治046000；2.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西太原030001

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細(xì)胞對(duì)大多數(shù)細(xì)胞毒性藥物不敏感，因此，普遍認(rèn)為HCC 是一種化療抗性腫瘤［1-2］。目前，索拉非尼（sorafenib）、瑞戈非尼（regorafenib）和樂伐替尼（lenvatinib）已經(jīng)FDA 批準(zhǔn)用于治療 HCC 晚期患者［3-5］，這 3 種藥物均是血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）抑制劑，通過抑制血管新生發(fā)揮作用，但由于患者的耐藥性和不耐受性，其臨床應(yīng)用受到明顯限制。

HCC 發(fā)生發(fā)展涉及一系列復(fù)雜的信號(hào)通路（包括高度激活的RAS-BRAF-MEK-ERK（MAPK）和PI3K ／Akt ／ mTOR 信號(hào)通路）及受體酪氨酸激酶的異常表達(dá)［3］。癌細(xì)胞內(nèi)含有諸多能驅(qū)動(dòng)癌癥發(fā)生發(fā)展的突變，但并不是針對(duì)每種突變的治療方案都取得了成功，如 BRAF 抑制劑針對(duì) BRAF V600E ／ K 突變的黑色素瘤效果顯著，但對(duì)攜帶相同BRAF V600E 突變的結(jié)直腸癌和甲狀腺癌無效［6］。BRAF 是MAPK 通路成員之一，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及其他細(xì)胞反應(yīng)［7］。HCC 組織中有 BRAF V600E 突變，但癌旁正常組織中無該突變，表明BRAF V600E 突變具有腫瘤特異性［8］。攜帶BRAF 突變的HCC 患者惡化率更高，表明 BRAF 突變是 HCC 治療的潛在靶點(diǎn)［8］。Src 激酶在多種癌細(xì)胞的增殖、存活、黏附、侵襲和遷移過程中發(fā)揮重要作用［9］，Src 激酶抑制劑在多種實(shí)體腫瘤的臨床實(shí)驗(yàn)中治療效果不佳［10-12］，推測Src 可能只是多驅(qū)動(dòng)增殖癌細(xì)胞中的增殖驅(qū)動(dòng)基因之一。聯(lián)合使用靶點(diǎn)不重合的抑制劑可能對(duì)腫瘤治療產(chǎn)生強(qiáng)協(xié)同效應(yīng)，如dasatinib 是一種針對(duì) Src、Abl、PDGFR 和c-Kit 的酪氨酸激酶抑制劑，已用于治療費(fèi)城染色體陽性白血病、對(duì)imatinib 有抗藥性的慢性粒細(xì)胞白血病及多種實(shí)體瘤［13-15］。前期研究表明，聯(lián)合使用Src 抑制劑dasatinib 和BRAF 抑制劑PLX-4720 可協(xié)同抑制乳頭狀甲狀腺癌和間變性甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，還可增加免疫細(xì)胞的浸潤，減小體內(nèi)腫瘤體積［16-18］。

大多數(shù)癌細(xì)胞是多驅(qū)動(dòng)增殖，藥物的實(shí)際抑制作用在低濃度范圍內(nèi)比單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)擬合曲線預(yù)測效果好，而在高濃度范圍則相反，因此藥物抑制細(xì)胞活力50%時(shí)的濃度（IC50）不能準(zhǔn)確反映多驅(qū)動(dòng)增殖癌細(xì)胞對(duì)激酶抑制劑的反應(yīng)。雙相動(dòng)力學(xué)公式對(duì)抑制數(shù)據(jù)的擬合程度更好，比單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)公式計(jì)算結(jié)果低5 ~ 10 倍，可更好地表明細(xì)胞與藥物之間的相互作用［12］。本研究分別采用單靶點(diǎn)和雙相動(dòng)力學(xué)公式分析肝癌細(xì)胞SNU-387 對(duì)11 種酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)，通過觀察擬合曲線的適應(yīng)度和殘差平方和（the sums of squared residues，SSR），比較兩種公式分析細(xì)胞-藥物相互作用的有效性，分析藥物聯(lián)合使用對(duì)SNU-387 細(xì)胞增殖和信號(hào)通路的影響，為藥物進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人 HCC 細(xì)胞系 SNU-387（STR 鑒定正確）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 dasatinib、BMS-754807、AZD6244、AZD6482、BGJ-398、bosutinib、crizotinib、gefitinib、imatinib、sunitinib 購自美國 Selleck Chemicals 公司；HG6-64-1 購自美國 MedChemExpress 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國 Gibco 公司；MTT 和 DMSO 購自北京索萊寶生物有限公司；兔抗Src、磷酸化Src（p-Src）、MEK1 ／ 2、磷酸化 MEK（p-MEK）、ERK1 ／ 2、磷酸化 ERK（p-ERK）、PDK1、磷酸化 PDK1（p-PDK1）、AKT、磷酸化 AKT（p-AKT）、IRβ、磷酸化 IRβ（p-IRβ）、IGF-1Rβ、磷酸化 IGF-1Rβ（p-IGF-1Rβ）、BRAF、p-BRAF單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司；小鼠抗GADPH 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 和羊抗鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL 發(fā)光試劑檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% FBS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基，將 SNU-387 細(xì)胞于 37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 ~ 5 d，傳代，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 SNU-387 細(xì)胞對(duì)酪氨酸激酶抑制劑敏感性的檢測 采用MTT 法。將SNU-387 細(xì)胞，按1×103個(gè)／孔加入96 孔板37 ℃孵育24 h；棄培養(yǎng)基，加入11種酪氨酸激酶抑制劑（AZD6244、AZD6482、BGJ398、BMS-75-4807、bosutinib、crizotinib、dasatinib、gefitinib、imati-nib、sunitinib、HG6-64-1），每種抑制劑均設(shè)10 nmol ／ L、100 nmol ／ L、1 μmol ／ L 和 10 μmol ／ L 4 個(gè)濃度，200 μL ／孔，繼續(xù)培養(yǎng) 72 h；加入 5 mg ／ mL的 MTT，50 μL ／ 孔，37 ℃避光孵育 4 h；棄 MTT，加入DMSO，200 μL ／ 孔，37 ℃振蕩培養(yǎng) 10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解；用酶標(biāo)儀檢測A490和A750，計(jì)算細(xì)胞存活率（1 - 細(xì)胞抑制率）。每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次。經(jīng)10 μmol ／ L 酪氨酸激酶抑制劑處理后的細(xì)胞抑制率超過50%時(shí)，將相應(yīng)抑制劑從20 μmol ／ L 進(jìn)行倍比稀釋至 0.6 nmol ／ L，共 16 個(gè)濃度，按上述方法檢測，并計(jì)算IC50。

1.5 單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)分析 將BMS-754807、dasatinib和 HG6-64-1 3 種酪氨酸激酶抑制劑從 20 μmol／L 倍比稀釋至 0.6 nmol／L，作用于 SNU-387 細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)72 h 后，同1.4 項(xiàng)方法檢測并計(jì)算IC50，按下式計(jì)算相對(duì)抑制率，以抑制劑濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞相對(duì)存活率（1 - 相對(duì)抑制率）為縱坐標(biāo)，繪制單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)曲線。以IC50作為變量，將實(shí)驗(yàn)測得的細(xì)胞活力（1 - 相對(duì)抑制率）與公式所得細(xì)胞活力（通過動(dòng)力曲線獲得）之間的 SSR 最小化［12］，根據(jù)最小 SSR 計(jì)算出的IC50對(duì)曲線的適應(yīng)度最好，為最佳IC50。SSR是使用Microsoft Excel 中的Solver 程序計(jì)算所得。

1.6 雙相動(dòng)力學(xué)分析 同1.5 項(xiàng)方法培養(yǎng)細(xì)胞及計(jì)算IC50，并按下式計(jì)算相對(duì)抑制率，以抑制劑濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞相對(duì)存活率（1 - 相對(duì)抑制率）為縱坐標(biāo)，繪制雙相動(dòng)力學(xué)曲線。以F1、Kd1和Kd2作為變量，將實(shí)驗(yàn)測得的細(xì)胞活力（1 - 相對(duì)抑制率）與公式所得細(xì)胞活力（通過動(dòng)力曲線獲得）之間的SSR最小化［12］，根據(jù)最小 SSR 計(jì)算出的 F1、Kd1和 Kd2為最佳擬合參數(shù)。

式中F1是細(xì)胞中對(duì)抑制劑的敏感相，Kd1是F1相細(xì)胞的Kd，F(xiàn)2是細(xì)胞中對(duì)抑制劑的不敏感相，Kd2是F2相細(xì)胞的Kd，公式要求F1+ F2= 1。

1.7 酪氨酸激酶對(duì)信號(hào)通路影響的檢測 用BMS-754807、dasatinib 和 HG6-64-1 3 種酪氨酸激酶抑制劑稀釋為2 倍IC5（0濃度分別為1、3、1.5 μmol ／ L），分別作用于SNU-387 細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)3 h，同時(shí)設(shè)對(duì)照組（不進(jìn)行藥物處理）。經(jīng)RIPA 裂解液提取SNU-387 細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取 60 μg 蛋白，經(jīng) 12% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h；用TBST 洗滌3 次，分別 加入兔抗 Src、p-Src、MEK1 ／ 2、p-MEK、ERK1 ／ 2、p-ERK、PDK1、p-PDK1、AKT、p-AKT、IRβ、p-IRβ、IGF-1Rβ、p-IGF-1Rβ、BRAF、p-BRAF 單克隆抗體（均 1 ∶1 000稀釋）和小鼠抗GAPDH 單克隆抗體（1 ∶2 500 稀釋），4 ℃孵育過夜；用TBST 洗滌 3 次，加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠 IgG（均 1 ∶2 500 稀釋），37 ℃孵育 1 h；ECL 顯影。

1.8 藥物聯(lián)合使用對(duì)SNU-387 細(xì)胞增殖影響的檢測將 BMS-754807、HG6-64-1 和 dasatinib 3 種酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)行倍比稀釋，共16 個(gè)稀釋度（20 ~0.6 nmol／L），加入 SNU-387 細(xì)胞，于 37 ℃處理 72 h；按1.4 項(xiàng)方法計(jì)算IC50及IC70，并根據(jù)Chou-Talalay公式［19］計(jì)算減量指數(shù)（dose reduction index，DRI），以評(píng)價(jià)藥物組合與單藥比較，達(dá)到相同抑制水平減少藥物濃度的倍數(shù)［19-20］。

2 結(jié) 果

2.1 SNU-387 細(xì)胞對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的敏感性經(jīng) 10 μmol／L 抑制劑處理后，SNU-387 細(xì)胞抑制率超過50%的蛋白激酶抑制劑有AZD6244、BGJ-398、BMS-754807、bosutinib、crizotinib、gefitinib、imatinib、sunitinib和 HG6-64-1，見圖 1。SNU-387 細(xì)胞對(duì) BMS-754807 和HG6-64-1 比較敏感，IC50分別為（0.934 ± 0.030）和（0.730 ± 0.142）μmol ／ L；對(duì) 1 μmol ／ L 的 dasatinib比較敏感，高濃度dasatinib 反而促進(jìn)SNU-387 細(xì)胞增殖，IC50難以確定；對(duì)imatinib 不敏感。因此，選擇BMS-754807、dasatinib、HG6-64-1 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 蛋白激酶抑制劑對(duì)SNU-387 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of protein kinase inhibitors on proliferation of SNU-387 cells

2.2 單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)分析 BMS-754807 抑制SNU-387細(xì)胞的IC50［（0.934 ± 0.030）μmol ／ L］比實(shí)際抑制率達(dá)50%時(shí)的濃度高。dasatinib 濃度高1 μmol ／ L時(shí)反而促進(jìn)SNU-387 細(xì)胞增殖，IC50難以確定，單相公式擬合曲線的SSR 達(dá)1.369，擬合度不佳，藥物的實(shí)際抑制作用與最佳擬合曲線不符；在低濃度范圍內(nèi)，抑制劑的實(shí)際抑制作用比最佳擬合曲線更有效。HG6-64-1 抑制 SNU-387 細(xì)胞的 IC50為（0.730 ±0.142）μmol／L，SSR 為 0.033。見圖 2。表明單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)曲線并不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞經(jīng)藥物處理的變化。

圖2 SNU-387 細(xì)胞經(jīng)蛋白激酶抑制劑處理后的單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果Fig.2 Single-target kinetic analysis of SNU-387 cells treated with protein kinase inhibitors

2.3 雙相動(dòng)力學(xué)分析 BMS-754807、dasatinib 和HG6-64-1 對(duì) SNU-387 細(xì)胞F1相增殖抑制作用顯著。BMS-754807 處理 SNU-387 細(xì)胞的 F1約為37%，表明BMS-754807 抑制37% SNU-387 細(xì)胞的增殖，Kd1為（5.1 ± 1.7）nmol ／ L，比IC50［（0.934 ±0.030） μmol ／ L］更準(zhǔn)確地反映 BMS-754807 和SNU-387 之間的關(guān)系；F2約為63%，表明其他細(xì)胞對(duì)該抑制劑不敏感，Kd2=（7.1 ± 1.3）μmol ／ L（ >5 μmol／L）。dasatinib 抑制約 40%SNU-387 細(xì)胞的增殖，Kd1為（3.9 ± 1.9）nmol ／ L，雙相公式擬合曲線的擬合度優(yōu)于單相公式，SSR 降低約24 倍。HG6-64-1 抑制約 57% SNU-387 細(xì)胞的增殖，Kd1為（252 ±82）nmol ／ L，抑制另外 43%細(xì)胞增殖，Kd2為（2.8 ±0.6）μmol ／ L，由于兩條擬合曲線的 SSR 相似，尚未明確SNU-387 細(xì)胞對(duì)HG6-64-1 的反應(yīng)是單相還是雙相。見圖3。

圖3 SNU-387 細(xì)胞經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑處理后的雙相動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果Fig.3 Kinetic analysis of SNU-387 cells after treatment with tyrosine kinase inhibitors

2.4 酪氨酸激酶對(duì)信號(hào)通路的影響 BMS-754807 能夠部分抑制IR 磷酸化，完全抑制Ser473 位點(diǎn)Akt磷酸化。dasatinib 能夠完全抑制Y416 位點(diǎn)Src 磷酸化，也能夠抑制 Y527 位點(diǎn) Src 磷酸化，5 μmol ／ L dasatinib 能夠激活Erk 磷酸化，與2.1 項(xiàng)結(jié)果一致。HG6-64-1 能夠顯著抑制Mek 磷酸化，但不能完全抑制Mek 磷酸化，推測有BRAF 同基因家族基因CRAF或ARAF 等其他形式存在，使Mek 激活。見圖4。

圖4 Western blot 法檢測酪氨酸激酶抑制劑對(duì)信號(hào)通路的影響Fig.4 Analysis of effect of tyrosine kinase inhibitors on signaling pathways of SNU-387 cells by Western blot

2.5 藥物聯(lián)合使用對(duì)SNU-387 細(xì)胞增殖的影響B(tài)MS-754807 與dasatinib 聯(lián)合使用的協(xié)同抑制效果不顯著；BMS-754807 與HG6-64-1 聯(lián)合使用的IC50和 IC70分別為（195 ± 6）和（442 ± 7）nmol ／ L，均顯著低于單獨(dú)使用時(shí)的IC50和IC70，50%抑制率時(shí)，DRI 約為 2 倍以上，表明 BMS-754807 與 HG6-64-1聯(lián)合使用的效果約為單藥處理的2 倍。HG6-64-1 和dasatinib 聯(lián)合使用抑制細(xì)胞活力50%時(shí)，效果是單藥處理的 5 倍。見圖 5。BMS-754807、HG6-64-1 和dasatinib 聯(lián)合使用的 IC50和 IC70分別為（15 ± 1）和（42±3）nmol／L，均顯著低于每種藥物單獨(dú)使用或兩藥組合的 IC50和 IC70，當(dāng) 3 種藥物濃度均 >0.3 μmol／L時(shí)，SNU-387 細(xì)胞的活力幾乎被完全抑制。見表1。

圖5 酪蛋白激酶聯(lián)合使用對(duì)SNU-387 細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Synergistic inhibitory effect of combination of tyrosine kinases on proliferation of SNU-387 cells

表1 酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合作用SNU-387 細(xì)胞后的IC50 和IC70（nmol ／ L）Tab.1 IC50 and IC70 values SNU-387 cells after combined treatment with tyrosine kinase inhibitors（nmol ／ L）

3 討 論

SNU-387 細(xì)胞基因組包含676 個(gè)編碼突變，包括 EGFR 突變（V819V），Pik3ca 突變（L735L）和NRAS 突變（Q61K）。本研究檢測SNU-387 細(xì)胞對(duì)11種酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)，結(jié)果表明，Src、Akt 信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路對(duì)于驅(qū)動(dòng)SNU-387 細(xì)胞增殖僅發(fā)揮部分作用，提示在SNU-387 細(xì)胞中這3條信號(hào)通路均發(fā)揮重要作用。其中，dasatinib 是一種廣譜的多靶點(diǎn)（包括 Src、Abl 和 PDGFR 等）蛋白酪氨酸激酶抑制劑，SNU-387 細(xì)胞對(duì)約 1 μmol ／ L dasatinib 比較敏感，但對(duì)高濃度dasatinib 不敏感；imatinib 是Abl 的有效抑制劑，但SNU-387 細(xì)胞對(duì)imatinib 不敏感，因此dasatinib 抑制的靶點(diǎn)不是Abl。

SNU-387 細(xì)胞對(duì) BMS-754807、dasatinib 和 HG6-64-1 的反應(yīng)說明了雙相分析的意義和局限。BMS-754807 是一種 IR ／IGF-1R 抑制劑［21-22］，對(duì) SNU-387 細(xì)胞的抑制作用非常符合雙相動(dòng)力學(xué)公式，該藥物抑制約 37%SNU-387 細(xì)胞的增殖，Kd1為（5.1 ±1.7）nmol／L。BMS-754807 也可抑制其他63%細(xì)胞的增殖，但Kd2高達(dá)（7.1 ± 1.3）μmol ／ L，這是該藥物對(duì) SNU-387細(xì)胞的脫靶效應(yīng)或毒性。由于dasatinib 濃度高于1 μmol ／ L 時(shí)反而促進(jìn) SNU-387 細(xì)胞增殖，dasatinib對(duì)該細(xì)胞的抑制作用既不遵守單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)公式，也不遵守雙相動(dòng)力學(xué)公式。但由雙相分析結(jié)果可知，dasatinib 顯著抑制約40%SNU-387 細(xì)胞的增殖。HG6-64-1 是一種 BRAF 抑制劑［23］，SNU-387 細(xì)胞對(duì)HG6-64-1 的反應(yīng)表明了雙相動(dòng)力學(xué)分析的另一個(gè)局限，兩種計(jì)算方法擬合的曲線非常相似，難以判斷SNU-387 細(xì)胞對(duì)HG6-64-1 的反應(yīng)是單相還是雙相，可是 Kd為（0.730 ± 0.142）μmol ／ L 的單相反應(yīng)，也可是 Kds分別為（252 ± 82） nmol ／ L 和（2.8 ±0.6）μmol ／ L 的雙相反應(yīng)（57% ／ 43%）。因此，當(dāng) F1和F2的Kds相差約10 倍時(shí)，較難區(qū)分藥物對(duì)細(xì)胞是單相還是雙相抑制；當(dāng)兩者相差100 倍或更多時(shí)，擬合曲線明顯不同。對(duì)于大多數(shù)藥物，Kd1和Kd2相差越大，雙相分析越有意義。

雙相分析為評(píng)估多驅(qū)動(dòng)增殖癌細(xì)胞對(duì)靶向治療的反應(yīng)提供了新的框架，雙相分析也能夠解釋為何有些蛋白激酶抑制劑在實(shí)驗(yàn)室被證明有效，但臨床上收效甚微，如Src 已被證明在多種癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［9］，但Src 抑制劑在臨床上表現(xiàn)并不佳［10-11］。推測可能是由于Src 只是多驅(qū)動(dòng)增殖癌細(xì)胞中的一個(gè)驅(qū)動(dòng)因素，因此，單獨(dú)使用Src 抑制劑并不能有效抑制癌細(xì)胞增殖。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，尚無癌癥或細(xì)胞系能僅由Src 驅(qū)動(dòng)增殖，在SNU-387 細(xì)胞中，Src 可能也只是增殖驅(qū)動(dòng)因素之一。dasatinib 處理 SNU-387 細(xì)胞的 IC50低于 1 μmol ／ L，因此可得出結(jié)論dasatinib 能有效抑制SNU-387 細(xì)胞增殖。但由于dasatinib 對(duì)SNU-387 細(xì)胞的影響包括靶點(diǎn)特異性和脫靶毒性，如dasatinib 在不依賴于毒性時(shí)，對(duì)SNU-387 細(xì)胞的抑制率低于50%（約為40%）。

多驅(qū)動(dòng)增殖細(xì)胞對(duì)某一激酶抑制劑的反應(yīng)是兩種作用的混合，即低Kd（nmol ／ L 級(jí)）的靶點(diǎn)特異性抑制F1相和高Kd（μmol ／ L 級(jí)）的脫靶毒性F2相。一方面，幾乎所有的抑制作用均發(fā)生于F1相；另一方面，IC50不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)，SSR 值較高，單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)公式計(jì)算出的最佳擬合IC50值通常與目測擬合曲線推測值不同，因此，F(xiàn)1和Kd1能夠更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞-藥物相互作用。敏感的靶點(diǎn)特異性抑制（F1相）是靶向治療的基礎(chǔ)，不敏感的脫靶毒性可能會(huì)限制靶向治療的有效性［12］。在單基因驅(qū)動(dòng)增殖細(xì)胞中，F(xiàn)1相就能完全抑制細(xì)胞增殖，不受毒性限制，對(duì)于SNU-387 細(xì)胞來說，F(xiàn)1相僅能部分抑制細(xì)胞增殖，若想使用單藥完全抑制細(xì)胞增殖，僅能通過提高給藥濃度，這必須考慮脫靶毒性。這種依賴于F2相才能實(shí)現(xiàn)完全抑制的效應(yīng)在臨床上不可避免會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閯┝恳蕾囆远拘?。藥物?lián)合使兩種或多種藥物的F1相組合即能顯著抑制細(xì)胞增殖，減少（若不能完全消除）劑量依賴性毒性。因此，使用雙相動(dòng)力學(xué)公式區(qū)分靶點(diǎn)特異性抑制和脫靶毒性有助于快速發(fā)現(xiàn)有前途的藥物組合。

若細(xì)胞多驅(qū)動(dòng)增殖機(jī)制正確，選擇F1相靶點(diǎn)不重合的抑制劑進(jìn)行組合，能夠產(chǎn)生強(qiáng)協(xié)同抑制作用。本研究的雙相分析和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，dasatinib以（3.9 ± 1.9）nmol ／ L 的 Kd1抑制 Src 和 40%的SNU-387 細(xì)胞活力，BMS-754807 抑制 Akt 途徑和37%的SNU-387 細(xì)胞增殖，Kd1為（5.1 ± 1.7）nmol／L，HG6-64-1 以（252 ± 82）nmol／ L 的 Kd1阻斷了 MAPK途徑和57%的SNU-387 細(xì)胞活力。由于這3 種藥物F1相靶點(diǎn)不重合，阻斷獨(dú)立的信號(hào)通路，3 藥聯(lián)合使用，濃度均高于 0.3 μmol ／ L 時(shí)，SNU-387 細(xì)胞幾乎被完全抑制，IC50和 IC70分別為（15 ± 1）和（42 ±3）nmol ／ L，均顯著低于每種藥物單獨(dú)使用或兩藥組合的相關(guān)數(shù)值。另外，dasatinib 能夠完全抑制Y416 位點(diǎn)Src 磷酸化，也能夠通過抑制Csk 抑制Y527 位點(diǎn) Src 磷酸化［24-25］，這與報(bào)道 Src 和 Csk 均對(duì) dasatinib 很敏感的結(jié)果一致［26］。

綜上所述，BMS-754807，HG6-64-1 和 dasatinib在SNU-387 細(xì)胞中的靶點(diǎn)并不重合，SNU-387 細(xì)胞是多驅(qū)動(dòng)增殖，3 種藥物聯(lián)合使用能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，可能是一種治療肝癌的潛在藥物組合。今后將使用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)該藥物組合的有效性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。