牛多瘤病毒PCR 檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證

牛步青，胡術(shù)然，高有，張海浩，陳蕾西，常亞軍，易力，姚宇峰，任芳芳

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650503

牛多瘤病毒（bovine polyomavirus，BPyV）是一種無(wú)包膜的閉環(huán)雙鏈DNA 病毒，屬于多瘤病毒科（Polyomaviridae）［1-2］。BPyV 基因組大小約為 4 700 bp，GC 占比為41.41%，包含6 種蛋白質(zhì)編譯基因，其病毒顆粒大小為 40 ～ 45 nm［2-3］。BPyV 最早在 1974 年從被污染的獼猴腎細(xì)胞（macaque kidney cell）培養(yǎng)物中分離得到，并可在 MRC-5、MDBK、FRhK-4、Vero和 MA104 細(xì)胞中復(fù)制增殖［1，4］。

BPyV 為頑固污染物，存在于牛血清、牛肉產(chǎn)品，甚至污水和垃圾中［3］。全球70%批次的牛血清均暴露在被BPyV 污染的風(fēng)險(xiǎn)下［4］。商業(yè)用途的牛血清中常發(fā)現(xiàn)BPyV 的DNA，而且其基因也可導(dǎo)致感染［2］。感染BPyV 后可能會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤，現(xiàn)已證明，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中BPyV 基因組DNA 前段和呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）啟動(dòng)子組成的重組病毒能在嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞中致瘤［4］。多瘤病毒目前僅在免疫抑制人群中產(chǎn)生病理學(xué)癥狀，但BPyV 的潛在致病性不容忽視［2］。

雖然新的疫苗生產(chǎn)工藝正轉(zhuǎn)向無(wú)血清培養(yǎng)基，但仍有很多疫苗使用血清生產(chǎn)［2］。使用被BPyV 污染的牛血清生產(chǎn)人用生物制品會(huì)產(chǎn)生極大的風(fēng)險(xiǎn)，而且多瘤病毒較強(qiáng)的滅活抗性加劇了此擔(dān)憂［2，4］。《美國(guó)藥典》已建議使用合適的方法檢測(cè)用于生產(chǎn)人用生物制品的牛血清中的BPyV［5］。因此，建立一種快速便捷的方法檢測(cè)牛血清中可能存在的BPyV污染對(duì)人用疫苗的安全性保障具有重要意義。

本研究設(shè)計(jì)了2 對(duì)BPyV 的特異性引物及1 個(gè)BPyV 陽(yáng)性重組質(zhì)粒，建立了BPyV PCR 檢測(cè)方法，并對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化、驗(yàn)證及初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒 Vero 細(xì)胞（ATCC CCL-81）、MDBK細(xì)胞（牛腎細(xì)胞，ATCC CL-22）和BT 細(xì)胞（牛鼻甲骨細(xì)胞，ATCC CRL-1390）各 1 批及牛腺病毒 3 型（bovine adenovirus 3，BAV，ATCC VR-639）、牛細(xì)小病毒（bovine parvovirus，BPV，ATCC VR-767）毒種均由 ATCC 提供；1 批KMB17 細(xì)胞（人胚肺二倍體細(xì)胞）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供。

1.2 主要試劑及儀器 PCR 試劑Premix TaqTMVersion 2.0 plus dye、病毒DNA 提取試劑盒MiniBEST Viral RNA ／DNA Extraction Kit Ver.5.0、DL500 DNA marker 和50 bp DNA Ladder 均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；MEM 培養(yǎng)基干粉購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所中心供應(yīng)科配置液體培養(yǎng)基；Gelred 核酸染料購(gòu)自美國(guó)Biotium 生物技術(shù)公司；NanoDrop2000 分光光度計(jì)和SimpliAmpTMThermal Cycler 核酸擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；VersaDoc 4000MP 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建及引物合成 根據(jù)NCBI 中登錄的BPyV 主要衣殼蛋白基因序列（BPyV_gp4 VP1，NC_001442.1）合成大小為 610 bp 的基因序列（1 996 ～2 605 bp），連接入pUC57 質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒BPyV-frag。

使用NCBI 中提供的Primer-BLAST 設(shè)計(jì)并選取針對(duì) BPyV VP1 的 2 對(duì)引物：3PF5′-AGGTGGCGAACCACTTGAAA-3′與 3PR5′-GCACCTGGGATTTGTTGCTG-3′；9PF5′-TAGAGGCCTTCCCAGGTACA-3′與9PR5′-TGGCTAGTAACAGGTGGCAG-3′。引物對(duì) 3PF、3PR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 113 bp，引物對(duì) 9PF、9PR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為120 bp。

重組質(zhì)粒和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，之后干粉使用TE 緩沖液（pH = 8.0）稀釋。重組質(zhì)粒溶解后使用Nanodrop2000 分光光度計(jì)定量。

1.4 方法的建立及PCR 退火溫度的優(yōu)化 以構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系共50 μL，包含 Premix TaqTMVersion 2.0 plus dye 反應(yīng)溶液 25 μL，終濃度 0.1 μmol ／ L 的正向與反向引物，10 μL 濃度為 400 fg ／ μL 的 BPyV-frag 重組質(zhì)粒模板和滅菌去離子水。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，退火（56、58、60 ℃）30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸 5 min。

1.5 方法的驗(yàn)證

1.5.1 靈敏度 用TE 緩沖液（pH = 8.0）將BPyV-frag 重組質(zhì)粒分別稀釋至 100 fg ／ μL （2.79 × 104copies ／ μL）、40 fg ／ μL（1.12 × 104copies ／ μL）、20 fg ／μL（5.58 × 103copies／μL）、10 fg ／μL（2.79 ×103copies ／ μL）、4 fg ／ μL（1.12 × 103copies ／ μL）、2 fg ／ μL（5.58 × 102copies ／ μL）。以稀釋后的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)使用含Gelred 核酸染料的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按下式計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)。

1.5.2 特異性 用MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.5.0 提取 2 種 102CCID50／ mL 的牛源DNA 病毒 BAV 和 BPV DNA，使用 Nanodrop2000 分光光度計(jì)定量，以 2 fg ／ μL 的 BPyV-frag 重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌去離子水作為陰性對(duì)照，采用建立的PCR 法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)上清液的檢測(cè) 用MEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) Vero、MDBK、KMB17、和 BT 細(xì)胞，各取 1 批細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入終濃度為 2 fg ／ μL 的 BPyV-frag 重組質(zhì)粒，制成恢復(fù)對(duì)照，以滅菌去離子水稀釋的BPyV-frag 重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，終濃度為 2 fg ／ μL，滅菌去離子水為陰性對(duì)照。用MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.5.0 提取各組樣品DNA，以其為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

2 結(jié) 果

2.1 PCR 退火溫度的優(yōu)化

2.1.1 引物對(duì)9PF、9PR 引物對(duì)9PF、9PR 在退火溫度56、58、60 ℃下均能擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度100 ～ 150 bp的目的條帶，退火溫度58 ℃時(shí)條帶最明亮。因此，在需要獲得最高擴(kuò)增效率時(shí)應(yīng)選擇58 ℃退火溫度；由于更高退火溫度特異性更強(qiáng)，要獲得最佳特異性應(yīng)選擇60 ℃退火溫度。本研究后續(xù)試驗(yàn)選擇60 ℃退火溫度。見(jiàn)圖1。

圖1 引物9PF 與9PR 的退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of temperature for annealing in PCR（primers 9PF ／ 9PR）

2.1.2 引物對(duì)3PF、3PR 引物對(duì)3PF 與3PR 在退火溫度56、58、60 ℃下均能擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度100 ～150 bp 的目的條帶，退火溫度60 ℃時(shí)條帶最明亮；且由于更高退火溫度特異性更強(qiáng)，因此選擇60 ℃退火溫度以保證最佳的擴(kuò)增效率和特異性。見(jiàn)圖2。

圖2 引物3PF 與3PR 的退火溫度優(yōu)化Fig.2 Optimization of temperature for annealing in PCR（primers 3PF ／ 3PR）

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 靈敏度 引物 3PF、3PR 與 9PF、9PR 在各 BPyV-frag 重組質(zhì)粒濃度下均可擴(kuò)增出100 ～150 bp 的目的條帶，2 個(gè)引物對(duì)的靈敏度均達(dá) 2 fg ／ μL，即558 copies ／ μL。與引物 3PF、3PR 相比，9PF、9PR 的條帶更明亮。表明該方法具有較高的高靈敏度，引物對(duì)9PF、9PR 的靈敏度略高于3PF、3PR。見(jiàn)圖3。

圖3 方法的靈敏度驗(yàn)證Fig.3 Verification for sensitivity of PCR assay

2.2.2 特異性 引物 3PF、3PR 和 9PF、9PR 以高濃度的BPV DNA（101.6ng／μL）和BAV DNA（97.5 ng／μL）為模板時(shí)，均無(wú)擴(kuò)增條帶；微量BPyV-frag 重組質(zhì)粒產(chǎn)生擴(kuò)增條帶。表明引物3PF、3PR 和9PF、9PR 均具有良好的特異性。見(jiàn)圖4。

圖4 方法的特異性驗(yàn)證Fig.4 Verification for specificity of PCR assay

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液的檢測(cè) BT、MDBK、KMB17、Vero 細(xì)胞培養(yǎng)上清液無(wú)擴(kuò)增條帶；加入終濃度為2 fg ／ μL BPyV-frag 重組質(zhì)粒的各細(xì)胞培養(yǎng)上清液均擴(kuò)增出100 ～150 bp 的目的條帶；陽(yáng)性對(duì)照均擴(kuò)增出100 ～150 bp 的目的條帶，且與各自對(duì)應(yīng)圖片中的重組質(zhì)粒加細(xì)胞培養(yǎng)上清液組條帶亮度一致。引物9PF、9PR 擴(kuò)增的各條帶均亮于引物3PF、3PR擴(kuò)增的條帶，引物 9PF、9PR 和 3PF、3PR 的條帶均亮于對(duì)應(yīng)靈敏度試驗(yàn)中濃度為2 fg ／ μL 的BPyV-frag重組質(zhì)粒的條帶。見(jiàn)圖5 和圖6。表明引物9PF、9PR 和3PF、3PR 能檢測(cè)到 BT、MDBK、KMB17、Vero細(xì)胞培養(yǎng)上清液中終濃度為2 fg ／ μL 的BPyV-frag重組質(zhì)粒。DNA 提取步驟和各細(xì)胞培養(yǎng)上清液成分對(duì)本實(shí)驗(yàn)方法無(wú)明顯抑制作用。DNA 提取步驟中樣品為200 μL，洗脫時(shí)無(wú)菌去離子水用量為50 μL，因此可能造成了濃縮的效果，進(jìn)而使圖片中條帶較靈敏度試驗(yàn)亮度更高。樣品BT、MDBK、KMB17、Vero細(xì)胞培養(yǎng)上清液中不含BPyV。

圖5 引物3PF、3PR 的細(xì)胞培養(yǎng)上清液PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoretic profile of PCR products of cell culture supernatant（primers 3PF ／ 3PR）

圖6 引物9PF、9PR 的細(xì)胞培養(yǎng)上清液PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoretic profile of PCR products of cell culture supernatant（primers 9PF ／ 9PR）

3 討 論

獸用活疫苗中已檢測(cè)到BPyV［6］，而牛血清是最可能的污染來(lái)源。細(xì)胞培養(yǎng)可排除在牛血清中殘存的 BPyV DNA 和無(wú)活性的 BPyV 顆粒［4］，在一定程度上降低BPyV 污染造成的風(fēng)險(xiǎn)。但微量、有活性的BPyV 仍很難被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。

在本所疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，牛血清是常用的原材料，而疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中易被原材料所攜帶的外源性病毒污染。目前已發(fā)現(xiàn)有多種可感染人類的牛源人畜共患疾病病毒，因此，對(duì)牛血清的外源病毒因子進(jìn)行嚴(yán)格檢查，在疫苗的質(zhì)量控制中十分必要。根據(jù)《中國(guó)藥典》四部（2020 版）要求［7］，細(xì)胞培養(yǎng)用的牛血清至少要檢測(cè)牛腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、牛副流感病毒3 型、呼腸孤病毒3 型、牛腺病毒和狂犬病病毒6 種病毒。

目前，在《中國(guó)藥典》四部（2020 版）以及《美國(guó)藥典》USP41 中規(guī)定對(duì)牛血清進(jìn)行病毒檢查，其中終端血吸附檢查分別在細(xì)胞培養(yǎng)14 與21 d 后進(jìn)行［5，7］。但在多種靈長(zhǎng)類和牛源細(xì)胞上接種量為3.1 × 108g.e（.the number of genome equivalents）的BPyV 進(jìn)行培養(yǎng)，明顯的BPyV 增殖在培養(yǎng)28 d 后才能檢測(cè)到［4］。BPyV 增殖緩慢，且使用牛腎細(xì)胞培養(yǎng)10 周后仍未出現(xiàn)細(xì)胞病變［4］。增殖緩慢和不造成細(xì)胞病變的病毒會(huì)造成陰性的血吸附檢查結(jié)果［8］。因此，用傳統(tǒng)的直接觀察法和血吸附檢測(cè)法檢測(cè)BPyV 污染會(huì)有一定困難。BPyV 污染的檢測(cè)應(yīng)選擇對(duì)BPyV 敏感，易產(chǎn)生細(xì)胞病變的指示細(xì)胞。傳統(tǒng)外源病毒因子檢查法的終端檢測(cè)可能需要配合更加靈敏的BPyV 檢測(cè)方法，如qPCR 或PCR。

無(wú)血清培養(yǎng)基為潛在的BPyV 污染提供了一種可能的解決方案。傳統(tǒng)的MEM 培養(yǎng)基被廣泛用于培養(yǎng)細(xì)胞和擴(kuò)增病毒，其中的牛血清是提供細(xì)胞生長(zhǎng)的重要成分。但牛血清可能含有病毒等多種污染物［9］。為了解決此問(wèn)題，目前已設(shè)計(jì)出數(shù)種無(wú)血清培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基可支持Vero、CHO、MDCK 等細(xì)胞的生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道［10］，無(wú)血清培養(yǎng)基PER.C6 可用于生產(chǎn)基于Vero 細(xì)胞的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗（inactivated poliovirus vaccine，IPV），其費(fèi)用更低，且病毒生產(chǎn)率比傳統(tǒng)培養(yǎng)基高近10 倍。在柯薩奇病毒B1 型（Coxsackievirus B1）疫苗的動(dòng)物試驗(yàn)中，為避免動(dòng)物源的污染使用了無(wú)血清培養(yǎng)基，疫苗在之后的鼠類動(dòng)物模型上表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫效果［11］。無(wú)血清培養(yǎng)基成功用于生產(chǎn)雞新城疫（Newcastle disease virus，NDV）疫苗，同時(shí)也由于無(wú)血清培養(yǎng)基成本低，滿足了獸用疫苗價(jià)格低廉的要求［12］。

本研究使用重組質(zhì)粒代替BPyV 作為陽(yáng)性樣品。重組質(zhì)粒與真正的BPyV 基因組模板擴(kuò)增效率可能有出入，從而導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)得出的靈敏度與真實(shí)情況有差異。但由于重組質(zhì)粒無(wú)病毒污染風(fēng)險(xiǎn)以及無(wú)市售BPyV 及其基因組參考品，用重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性樣品利于本方法在其他廠家進(jìn)行推廣和運(yùn)用。在后續(xù)研究中如遇到BPyV 污染樣品，將使用BPyV 進(jìn)一步驗(yàn)證本方法。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了BPyV 的PCR 檢測(cè)方法，并進(jìn)行了驗(yàn)證。引物3PF、3PR 和9PF、9PR 可用于檢測(cè)BT、MDBK、KMB17 和 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的BPyV，靈敏度均達(dá) 2 fg ／ μL（558 copies ／ μL）。引物3PF、3PR 的靈敏度略低于9PF、9PR。成功構(gòu)建了BPyV-frag 重組質(zhì)粒，并可作為陽(yáng)性對(duì)照代替BPyV。在牛血清外源病毒因子檢查中應(yīng)增加特異性檢查法，對(duì)BPyV 進(jìn)行PCR 檢測(cè)。無(wú)陽(yáng)性結(jié)果檢出則基本確定無(wú)活BPyV 存在，為疫苗的安全性提供了進(jìn)一步的保障。由于BPyV 增殖緩慢，需進(jìn)一步提高BPyV 檢測(cè)方法的靈敏度，加強(qiáng)檢測(cè)的可靠性。后續(xù)將探究BPyV 的 qPCR 檢測(cè)方法。