銅綠假單胞菌疫苗的研究進展

楊敬鵬，馬翠翠 綜述，王震玲 審校

1.國家藥品監(jiān)督管理局食品藥品審核查驗中心，北京100044；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室，四川成都610041

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又稱綠膿桿菌，是一種常見的條件致病菌，為革蘭陰性菌［1］。常見于院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染，包括下呼吸道、外科傷口、燒傷創(chuàng)面、泌尿道、角膜感染等。易感人群包括慢性阻塞性肺病患者、肺纖維化患者、免疫缺陷人群、重癥監(jiān)護室患者以及接受機械通氣的患者［2］。銅綠假單胞菌感染可導(dǎo)致肺炎患者和燒傷合并感染患者進一步形成敗血癥及膿毒血癥，肺炎致死率高達30%以上，敗血癥致死率可達80% ~ 90%［3］。

銅綠假單胞菌感染臨床主要以抗生素為治療手段，但由于其天然耐藥性以及獲得性耐藥的特點，目前仍缺乏有效的治療和控制策略。根據(jù)2020年CHINET 中國細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，臨床標(biāo)本中銅綠假單胞菌檢出率為8.42%，排名第四［4］。2019 年美國疾控中心將其列為嚴(yán)重威脅的耐藥細菌。銅綠假單胞菌復(fù)雜的耐藥機制主要包括外排泵、抗生素靶點突變、水解酶、生物膜等。因此，一般抗生素治療很難達到徹底清除細菌的目的，甚至產(chǎn)生更多的耐藥。疫苗接種作為一種有效的預(yù)防感染性（傳染性）疾病的手段，具有不可替代的地位。20世紀(jì)60 年代起，至少有60 種針對銅綠假單胞菌的疫苗在研，疫苗靶點包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）、鞭毛、外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）、細菌毒素、外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）等。疫苗的主要靶點見圖1。根據(jù)技術(shù)路線不同可分為組分疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗、全菌體滅活疫苗、載體疫苗。一些在研疫苗于臨床前動物試驗中表現(xiàn)出良好的保護效果，但進入臨床試驗階段的僅有7種，其中3 種進入Ⅲ期臨床階段，但均宣告失敗，目前尚無銅綠假單胞菌疫苗獲批上市［1］。見表1。

圖1 銅綠假單胞菌疫苗的主要靶點Fig.1 Main targets of P.aeruginosa vaccine

表1 銅綠假單胞菌疫苗的研發(fā)情況Tab.1 Research and development of P.aeruginosa vaccine

1 組分疫苗

1.1 LPS LPS 是革蘭陰性菌細胞膜外的主要成分，主要由脂質(zhì)A（lipid A）、核心寡糖（core oligosaccharide）和 O-抗原（O-antigen）構(gòu)成［40］。脂質(zhì) A 是 LPS的毒性成分，可導(dǎo)致人體發(fā)熱、腹瀉，甚至內(nèi)毒素性休克。O-抗原是區(qū)分細菌血清型的主要結(jié)構(gòu)成分，是疫苗研究的重要靶點。根據(jù)O-抗原不同，國際抗原分型系統(tǒng)（International Antigenic Typing System，IATS）將銅綠假單胞菌分為 20 個血清型（O1 ~ O20）［41］。

LPS 具有良好的免疫原性，但由于其O-抗原的多樣性，單一血清型疫苗僅能保護該血清型的細菌感染［42］，因此多價疫苗或許能獲得比單價疫苗更高的保護效果。20 世紀(jì)60 年代最早開始研發(fā)的Pseudogen?作為一種七價LPS 疫苗，在臨床試驗中能顯著提高燒傷患者的生存率［5］，但對于CF 患者臨床感染沒有改善。一種八價LPS 疫苗Aerugen?在隨機雙盲安慰劑對照的Ⅲ期臨床試驗中，將尚未感染銅綠假單胞菌的CF 患者與對照組進行療效比較，無明顯保護效果，在2006 年制造商終止了研發(fā)［6］。從上述兩個多價LPS 疫苗的臨床研究結(jié)果可以看出，以LPS 作為疫苗靶點，尚需克服血清交叉保護等問題。

有研究利用LPS 連接其他載體蛋白作為多糖結(jié)合疫苗，如將白喉毒素（diphtheria toxoid，DT）與LPS進行共價連接制備D-LPS-DT 疫苗，免疫小鼠后，與LPS 相比，能夠提高 4 倍 IgG 抗體滴度［7-8］。此外，基于LPS 中l(wèi)ipid A 制備的佐劑單磷酸脂質(zhì)A（monophosphoryl lipid A，MPL），已有以其作為佐劑成分的其他疫苗獲批上市［43］。

1.2 EPS 銅綠假單胞菌主要產(chǎn)生3 種EPS，即Psl、Pel 和藻酸鹽（alginate）。其中，藻酸鹽是黏液型銅綠假單胞菌生物膜（biofilm）的主要成分，其產(chǎn)量相對Psl 和Pel 高。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的EPS 結(jié)構(gòu)簡單，菌株間分子結(jié)構(gòu)相對保守，因此是可能的抗原靶點。有研究表明，感染患者可自然產(chǎn)生銅綠假單胞菌藻酸鹽的特異性抗體，不過這些抗體不能有效清除感染［9］。有研究將藻酸鹽與一些載體蛋白連接以提高其免疫原性，將ETA 與銅綠假單胞菌PA3064 的藻酸鹽制備成多糖結(jié)合疫苗，發(fā)現(xiàn)相對于藻酸鹽能夠在兔體內(nèi)產(chǎn)生更高水平的抗藻酸鹽抗體［10］。有研究將破傷風(fēng)類毒素與黏液型銅綠假單胞菌株P(guān)A8821M 的藻酸鹽偶聯(lián)形成多糖結(jié)合疫苗，用該疫苗腹腔免疫小鼠后可保護83%的小鼠免于致死性的腹腔感染［11］。有研究將 PAO1 的藻酸鹽、LPS、白喉毒素3 種組分結(jié)合制備多糖結(jié)合疫苗，與LPS 和白喉毒素合成的雙組分對照疫苗相比，可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生更高水平的抗體（P< 0.01）［12］。

1.3 OMV OMV 是一種直徑為20 ~ 250 nm 的囊泡樣結(jié)構(gòu)，是革蘭陰性菌在生長過程中分泌的。OMV包含了細菌中幾乎所有的生物成分，如肽聚糖、磷脂、LPS、蛋白等［44］。有研究報道，將從銅綠假單胞菌中分離出的OMV 與磷酸鋁佐劑聯(lián)用肌肉注射免疫小鼠，能保護90%的小鼠免于致死劑量的銅綠假單胞菌肺部感染，且具有異血清型交叉保護作用［13］。OMV 具有獨特的疫苗遞呈方式，可通過膜融合被免疫細胞吞噬，免疫遞送能力較強，同時又具有細菌幾乎全部成分，因此可作為銅綠假單胞菌研發(fā)的重要方向。

2 重組亞單位疫苗

2.1 鞭毛蛋白 鞭毛作為細菌運動的主要器官，其長度可達到甚至超過菌體長度，可作為一種重要的抗原，鞭毛的主要構(gòu)成成分為FliC 蛋白。TANOMAND 等［14］利用大腸埃希菌表達純化重組鞭毛蛋白FliC 與ETA 后制備的重組蛋白，在體外顯示出與患者血清的高親和力。有文獻報道了一種重組鞭毛-OMP 疫苗（fliCa，b-oprF-oprI），將其免疫小鼠能明顯清除肺部感染的銅綠假單胞菌［15］。還有研究者研發(fā)了一種蛋白聯(lián)合疫苗，包含重組肺炎克雷伯菌O-多糖和銅綠假單胞菌鞭毛蛋白，過繼轉(zhuǎn)移該疫苗的抗血清，可提高燒傷合并銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率［16］。BEHROUZ 等［17］評估了重組 b 型鞭毛蛋白疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性，發(fā)現(xiàn)該疫苗可顯著提高體液免疫及細胞免疫水平，能夠降低小鼠肝臟細菌荷載量，在燒傷膿毒癥小鼠模型中具有85.7%的保護率。

一項Ⅱ期臨床試驗中，20 名健康受試者經(jīng)肌肉注射鞭毛蛋白疫苗，免疫后2 周血清及肺泡灌洗液中的特異性抗體滴度顯著升高，在Ⅲ期臨床試驗CF患者中觀察到，接種疫苗組與安慰劑組比較死亡率降低了4.5%，但兩組的發(fā)病率無顯著差異［18-19］。研究結(jié)果提示，以鞭毛蛋白作為靶點雖然能產(chǎn)生特異性抗體，但對細菌清除無顯著效力，未顯著改善患者發(fā)病率?？赡苁潜廾珵榧毦潜匦杞Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致。在自然狀態(tài)下，銅綠假單胞菌存在有鞭毛和無鞭毛兩種細菌亞型，且鞭毛脫落后并不會導(dǎo)致細菌死亡。無鞭毛的細菌增殖分裂產(chǎn)生的新個體可根據(jù)環(huán)境需要選擇產(chǎn)生鞭毛或不產(chǎn)生鞭毛，因此鞭毛蛋白疫苗在抵御無鞭毛細菌感染時效力降低。

2.2 菌毛蛋白 菌毛是銅綠假單胞菌的主要黏附因子，通過菌毛黏附至宿主細胞上。Ⅳ型菌毛（type Ⅳpili，T4P）是一個多聚的、無分支的絲狀結(jié)構(gòu)，由數(shù)千個相同的PilA 蛋白單體組成。研究者嘗試?yán)弥亟M菌毛蛋白PilA 制備疫苗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻腔黏膜免疫小鼠誘導(dǎo)的血清抗體具有調(diào)理吞噬作用［20］。KORPI等［21］通過將PliA 和b 型鞭毛蛋白進行混合免疫小鼠，免疫后燒傷小鼠細菌荷載量降低。也有研究從銅綠假單胞菌PA1244 分離Pilin 免疫小鼠，可產(chǎn)生高滴度的特異性抗體水平，在小鼠急性肺炎模型和燒傷模型中均顯示出保護效力［22］。結(jié)果提示，菌毛蛋白可能是銅綠假單胞菌疫苗研發(fā)的重要靶點。另外，需要考慮的是，菌毛抗原在血清學(xué)上是異質(zhì)性的，可分為5 個不同的系統(tǒng)發(fā)育類群，因此針對菌毛的疫苗研發(fā)過程尚需要解決交叉保護的問題。

2.3 OMP 銅綠假單胞菌外膜上有許多蛋白，這些蛋白對維持細胞結(jié)構(gòu)、滲透壓、物質(zhì)交換、信息傳遞等具有重要作用，其中外膜孔蛋白OprF 和OprI 是研究較多的靶點。OprF ／ I 疫苗（又名 IC43）目前已完成Ⅲ期臨床試驗。在Ⅰ期臨床試驗中，肌肉注射IC43 在健康人群中能夠誘導(dǎo)特異性抗體［23］；在Ⅱ期臨床試驗中，IC43 組感染率與安慰劑組相比無顯著差異［24］；在Ⅲ期臨床試驗中，IC43 在機械通氣重癥監(jiān)護室（intensive Care Unit，ICU）患者中耐受性良好，能夠產(chǎn)生抗原特異性抗體，然而，總體死亡率與安慰劑組無顯著差異［25］。以 OprF ／ I 為靶點的 IC43疫苗在Ⅲ期臨床試驗中未顯示出較好的免疫保護效力，由于適應(yīng)癥選擇過重，進入ICU 的患者本身免疫系統(tǒng)可能已經(jīng)存在極大缺陷，這樣的受試者再接受疫苗免疫并不能產(chǎn)生良好的免疫效果。OMP 作為重要靶標(biāo)的可能，還需進一步研究。有研究者利用OprH進行小鼠鼻內(nèi)免疫，發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌菌株P(guān)A14肺部攻毒后有40%的保護效力［26］。另外，銅綠假單胞菌還有許多重要的OMP，如Opr86（BamA）、OprD、OprQ、OpdQ 等，均對細菌具有重要的作用，是潛在的疫苗靶點。同時，多抗原聯(lián)合的多價疫苗可能是最有希望的重組亞單位疫苗。

2.4 毒力因子 銅綠假單胞菌可產(chǎn)生多種毒力因子，其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）是產(chǎn)生這些毒力因子的重要分泌通道。T3SS 的原件包括PopB、PopD 和PcrV。PopB ／ PopD 在宿主細胞上形成孔道。有研究發(fā)現(xiàn)，PopB 鼻腔黏膜免疫小鼠后能保護小鼠免受致死劑量的銅綠假單胞菌株P(guān)AO1 誘導(dǎo)的肺部感染［27］。有研究設(shè)計將OMP 與Ⅲ型分泌系統(tǒng)的靶點蛋白聯(lián)用，旨在獲得更高的疫苗保護效力。FAKOOR等［28］將大腸埃希菌表達的 OprF ／ OprI ／ PcrV 重組蛋白疫苗組，與單獨的OMP OprF 或OprI 免疫組相比，該重組蛋白疫苗免疫的燒傷小鼠體現(xiàn)出更好的內(nèi)臟細菌清除能力。

ETA 是銅綠假單胞菌重要的毒力因子之一。有研究發(fā)現(xiàn)，使用分離柱純化制備的PA103 ETA 疫苗，能保護燒傷小鼠抵抗銅綠假單胞菌PA103 的攻擊［29］。彈性蛋白酶和堿性蛋白酶是銅綠假單胞菌破壞宿主免疫系統(tǒng)的重要毒力因子。有研究利用福爾馬林處理蛋白酶類毒素與彈性酶類毒素制備的疫苗，對銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的水貂出血性肺炎［30］、小鼠角膜潰瘍［31］和小鼠燒傷［32］均具有保護作用。SOKOL 等［33］將彈性蛋白酶多肽與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)合成疫苗，用該疫苗免疫大鼠后可降低銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肺部感染的細菌荷載量。

綜上所述，毒力因子作為銅綠假單胞菌疫苗重要靶標(biāo)，不僅可降低細菌定殖，還可在細菌感染過程中產(chǎn)生中和毒素的中和抗體，降低細菌對機體的損傷。但大多數(shù)毒力因子屬于分泌型蛋白，細菌產(chǎn)生后即脫離了菌體，因此該類抗原作為疫苗仍需聯(lián)合菌體抗原，才能達到更佳的免疫保護效果。

3 滅活疫苗

一種命名為Pseudostat?的口服銅綠假單胞菌疫苗，是利用甲醛滅活技術(shù)制備的凍干滅活疫苗，該疫苗在Ⅰ期臨床試驗中表現(xiàn)出較好的免疫原性和安全性［34］，但試驗因未知原因暫停。

有研究利用射線作為滅活手段制備全菌體滅活疫苗，如γ 射線被用于制備布魯菌和利什曼原蟲疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了有效的免疫保護［45-46］。相較于γ 射線，X 射線滅活技術(shù)可能是未來全菌體 ／ 全病毒滅活疫苗的主要技術(shù)手段。γ 射線來源于原子核的衰變或裂變，存在較大放射污染風(fēng)險，而X 射線可由電子加速產(chǎn)生，無污染殘留，安全性高且成本低廉，兩者均還處在早期技術(shù)開發(fā)階段。

本課題組報道過一種X 射線滅活的銅綠假單胞菌疫苗，其能夠調(diào)動細胞免疫，保護小鼠免受肺部致死劑量的感染，交叉保護異血清菌株的挑戰(zhàn)，對臨床碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌和多藥耐藥綠假單胞菌均有效［35］。X 射線通過高能射線破壞細菌核酸，使其失去增殖能力，達到滅活細菌的同時，最大限度的保護了菌體抗原結(jié)構(gòu)完整性，是較有希望的全菌體／全病毒滅活方式。進一步研究發(fā)現(xiàn)，X 射線輻照銅綠假單胞菌可產(chǎn)生大量含細菌核酸的外膜囊泡［47］。釋放的核酸物質(zhì)能夠激活樹突細胞的cGAS-STING通路，促進小鼠產(chǎn)生免疫記憶（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。利用X射線研發(fā)滅活疫苗中需重點探索輻照對菌體的影響因素和機理，不斷完善最佳劑量。

全菌體滅活疫苗滅活技術(shù)亟需推陳出新，傳統(tǒng)熱滅活、化學(xué)滅活等方式均在滅活細菌 ／ 病毒的同時破壞了疫苗重要的抗原結(jié)構(gòu)，這可能是傳統(tǒng)疫苗異血清型交叉覆蓋弱的重要原因。

4 減毒活疫苗

LóPEZ-SILES 等［36］通過缺失 PAO1 基因組的芳香族氨基酸合成基因aroA構(gòu)建了減毒活疫苗PAO1△aroA。研究結(jié)果顯示，在小鼠角膜感染模型中，主動免疫PAO1△aroA，或過繼兔抗PAO1△aroA血清可預(yù)防異血清型銅綠假單胞菌引起的角膜感染。雖然減毒活疫苗提示有較好的免疫效果，但實驗數(shù)據(jù)較少，有待進一步研究。

相對于其他技術(shù)路線的疫苗，減毒活疫苗最大程度上模擬病原體自然感染激發(fā)免疫反應(yīng)，是最具應(yīng)用潛質(zhì)的疫苗。但其在菌種篩選、減毒株構(gòu)建方面具有較大難度，往往毒力越弱的毒株，其免疫原性、保護效力也就越弱。同時減毒株存在返祖即毒力恢復(fù)的現(xiàn)象，需要較長時間的遺傳穩(wěn)定性考察。由于疫苗為活菌，對于免疫力低下人群免疫接種存在安全風(fēng)險，同時對臨床接種操作要求較高。因此，由于上述原因，減毒活疫苗難以成功。

5 細菌載體疫苗

減毒沙門菌常作為細菌疫苗載體，在一項減毒沙門菌表達銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF ／ OprI 疫苗的Ⅰ期臨床試驗中，健康志愿者分別通過肌肉、鼻內(nèi)和口服方式接種疫苗，免疫后血清抗體滴度均顯著升高，下呼吸道抗體僅在鼻內(nèi)和口服免疫組顯著升高［37］。該研究結(jié)果與重組亞單位疫苗IC43 研究結(jié)果基本一致，但缺乏更深入的研究數(shù)據(jù)。

6 腺病毒載體疫苗

腺病毒載體被廣泛應(yīng)用于重組疫苗研究，該疫苗使用腺病毒遞送病原體抗原片段以激發(fā)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強大的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)［48］。有研究者制備了表達OprF 的腺病毒疫苗（AdOprF.RGD.Epi8），該疫苗在小鼠致死肺炎模型中誘導(dǎo)了強的抗OprF 的細胞免疫和保護性免疫［38］。

腺病毒載體疫苗研發(fā)需要考慮如下問題：①抗原選擇。銅綠假單胞菌抗原復(fù)雜，需選擇主要的免疫保護抗原；②疫苗安全性。需注意接種腺病毒載體疫苗后可能出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)；③預(yù)存免疫。人群中普遍存在針對人源腺病毒的抗體，可顯著降低該類疫苗的免疫原性，通常需要使用抗原修飾和非人源腺病毒載體來避免預(yù)存免疫反應(yīng)。有研究者通過將OprF 的B 細胞表位整合至腺病毒的hexon 高變區(qū)，重復(fù)免疫小鼠來增強目標(biāo)蛋白特異性細胞和體液免疫反應(yīng)［39］。另外，人腺病毒的類型一般為Ad5 型，有研究者提出用非人靈長類腺病毒載體AdC7 來代替Ad5 作為載體來解決預(yù)存免疫的問題［38］。

7 結(jié)論與展望

迄今為止，雖然有許多疫苗已進行了臨床試驗或還處于臨床前研究階段，但尚無產(chǎn)品上市。以上研究結(jié)果提示，單一組分的靶點恐難有效預(yù)防或清除銅綠假單胞菌感染。同時也表明，銅綠假單胞菌疫苗研發(fā)面臨的主要問題在于尚無理想靶點進行疫苗設(shè)計，分析其原因在于：①銅綠假單胞菌的基因組龐大，因此具有強大的環(huán)境適應(yīng)能力，可在浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，其中生物膜的形成可幫助其逃避免疫監(jiān)視，同時銅綠假單胞菌也具有多種毒力分泌機制，能夠破壞免疫系統(tǒng)，為疫苗靶點的選擇帶來了困難；②缺乏理想的動物評價模型，如多為慢性阻塞性肺病患者、CF 患者、ICU 患者和免疫缺陷患者等發(fā)生銅綠假單胞菌感染，而臨床前研究階段多采用健康的動物模型，不能充分評價病理狀態(tài)下疫苗的保護效力；③缺乏異血清型交叉保護，從現(xiàn)有研究來看，部分候選疫苗目前缺乏足夠的異血清型臨床分離株的效力保護觀察；④臨床適應(yīng)癥的選擇。選擇過于嚴(yán)重的臨床適應(yīng)癥，會導(dǎo)致疫苗保護效果評價不夠客觀；⑤臨床方案的實施?，F(xiàn)有臨床診斷技術(shù)難以精確判定銅綠假單胞菌的早期感染和定植，給受試者入組、排除標(biāo)準(zhǔn)以及疫苗保護效力評價帶來困擾。

針對上述問題，一個可能的疫苗設(shè)計思路為：從工藝上，研發(fā)并采用新的技術(shù)，制備盡可能覆蓋細菌多種有效抗原物質(zhì)的綜合性疫苗，如全菌體疫苗、組分疫苗、多價疫苗等。同時，還需進一步深入了解銅綠假單胞菌的分子發(fā)病機制，充分利用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和反向疫苗學(xué)等新技術(shù)手段，開發(fā)多抗原聯(lián)合疫苗、組分疫苗或新一代滅活全菌體疫苗。在臨床適應(yīng)癥選擇、臨床方案設(shè)計、臨床效力評價指標(biāo)方面，還應(yīng)充分考慮可能導(dǎo)致疫苗失敗的風(fēng)險，做好風(fēng)險控制，提高疫苗成功的可行性。隨著各個領(lǐng)域研究的不斷深入，一定會研發(fā)出安全有效的銅綠假單胞菌疫苗，填補市場空白。