五海癭瘤丸中17種重金屬及有害元素殘留量測(cè)定及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估*

李成森，劉天竹，張 曄，郭漢文，施 法

（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.遼寧省沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110044；3.遼寧省沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110136）

五海癭瘤丸功效為軟堅(jiān)消腫，用于痰核癭瘤、瘰疬、乳核，臨床廣泛用于治療腫瘤［1］，由海帶、海藻、海螵蛸、蛤殼、昆布、海螺（煅）等多種海洋類來(lái)源中藥材組方，而海藻、昆布、海螵蛸均為《中國(guó)藥典》收載品種［2］。海洋來(lái)源中藥材的重金屬及有害元素殘留風(fēng)險(xiǎn)較高，2020年版《中國(guó)藥典（四部）》中規(guī)定：“海藻、昆布、海螵蛸的重金屬及有害元素限度為Pb＜5 mg/kg，Cd＜5 mg/kg，As＜10 mg/kg，Hg＜0.2 mg/kg，Cu＜20 mg/kg?！保?］本研究中采用微波消解和人工胃液仿生提取法進(jìn)行前處理，并以電感耦合等離子體－質(zhì)譜（ICP－MS）法測(cè)定五海癭瘤丸中鉛（Pb）、鎘（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、銅（Cu）、鋁（Al）、鈷（Co）、釩（V）、硒（Se）、鉬（Mo）、鉻（Cr）、鎳（Ni）、鐵（Fe）、銻（Sb）、錫（Sn）、鋰（Li）、鋇（Ba）17種重金屬及有害元素的殘留量，并對(duì)仿生提取能溶出的元素進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為臨床用藥的安全性提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7700型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Mars微波消解儀（美國(guó)CEM公司）；Milli－Q型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；CP225D型分析天平（精度為十萬(wàn)分之一），BSA224S－CW分析天平（精度為萬(wàn)分之一），均購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司。

1.2 試藥

ICP分析用多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GSM－M231901－2013，質(zhì)量濃度為100μg/mL），Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GSB 04－1750－2004，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL），Ge標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GSB 04－1728－2004，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL），銦（In）標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GSB 04－1731－2004，質(zhì) 量濃度 為1 000μg/mL），鉍（Bi）標(biāo)準(zhǔn) 溶液（批號(hào)為GSB04－1719－2004，質(zhì)量濃度為1000μg/mL），鈧（Sc）標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSB 04－1750－2004，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL），均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；ICP－MS貯備調(diào)諧溶液（含Co，Li，Ti，V，美國(guó)安捷倫公司，質(zhì)量濃度為10μg/mL）；硝酸（優(yōu)級(jí)純，F(xiàn)isher公司）；鹽酸、胃蛋白酶均為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；柑橘葉（地球物理地球化學(xué)勘察研究所，批號(hào)為GBW 10020＜GSB－11＞）；五海癭瘤丸（企業(yè)A，共15批）。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器參數(shù)

射頻功率：1.5 kW；等離子體氣流量：15 L/min；載氣流量：0.8 L/min；碰撞氣流量：0.4 L/min；氦氣流量：4～5 mL/min；霧化室溫度：2℃；樣品提升速率：0.3 r/s；采樣深度：8 mm。

2.2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液1：精密量取ICP分析用多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸稀釋成質(zhì)量濃度分別為1，2，5，10，20，50，100μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1。

標(biāo)準(zhǔn)溶液2：精密量取Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸稀釋成質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.8，2.0，4.0，10.0，20.0μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液2。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密量取Ge，In，Bi，Sc標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成質(zhì)量濃度為20μg/L的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

供試品溶液Ⅰ（總元素量）：取樣品0.3 g，精密稱定，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，精密加入硝酸10 mL，置微波消解儀內(nèi)，按表1程序消解。消解完成后，打開(kāi)消解罐，置趕酸器上120℃趕酸，待趕至3～5 mL時(shí)倒出消解液，用少量水洗滌消解罐3次，合并洗液，置50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液Ⅰ。同法制備空白樣品Ⅰ。

表1 微波消解程序Tab.1 Digestion procedure of microwave

供試品溶液Ⅱ（仿生提取液）：取樣品0.3 g，精密稱定，精密加入人工胃液（取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻，加水稀釋成1 000 mL，即得）30 mL，置37℃恒溫超聲提取2 h，4 000 r/min離心10 min，精密量取上清液25 mL，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，用趕酸器低溫濃縮至3 mL，冷卻，加入硝酸10mL，蓋上罐蓋后置微波消解儀中，同供試品溶液Ⅰ的制備方法制備供試品溶液Ⅱ。同法制備空白樣品Ⅱ。

2.3 測(cè)定方法

按同位素豐度表推薦的質(zhì)量數(shù)選取同位素，分別為208Pb，111Cd，75As，63Cu，27Al，51V，52Cr，56Fe，59Co，60Ni，96Mo，79Se，118Sn，121Sb，7Li，137Ba，202Hg。其中7Li，27Al，51V，52Cr，56Fe以45Sc作內(nèi)標(biāo)；59Co，60Ni，63Cu，96Mo，79Se，75As以72Ge作 內(nèi) 標(biāo)；111Cd，118Sn以115In作內(nèi) 標(biāo)；121Sb，137Ba，202Hg，208Pb以209Bi作內(nèi)標(biāo)。按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以各元素的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)（r）應(yīng)不低于0.995。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察、檢測(cè)限及定量限確定：取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按擬訂條件測(cè)定，以各元素質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表2。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20200303）適量，依法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各元素的含量及RSD。結(jié)果見(jiàn)表2，表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20200303）適量，在不同時(shí)間由不同人員按擬訂方法分別平行測(cè)定6次，計(jì)算各元素測(cè)定值的RSD。結(jié)果見(jiàn)表2，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫放置0，2，4，8，24，48 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，并用新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD。結(jié)果見(jiàn)表2，表明供試品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品1.5 g，精密稱定，置微波消解罐中，分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液1、標(biāo)準(zhǔn)溶液2各適量，加入微波消解罐中，加標(biāo)濃度分別為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的第2，3，4點(diǎn)3個(gè)濃度，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 17種重金屬及有害元素方法學(xué)考察結(jié)果Tab.2 Results of methodological investigations of 17 heavy metals and harmful elements

準(zhǔn)確度試驗(yàn)：以柑橘葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參考，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果基本相符，表明方法準(zhǔn)確可靠。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（柑橘葉）測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of standard materials（Citri Reticulatae Folium）

2.5 樣品含量測(cè)定

總元素量測(cè)定結(jié)果：取15批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試液，按擬訂條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中各元素的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 15批五海癭瘤丸中17種重金屬及有害元素的總元素含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n＝3）Tab.4 Determination results of total content of 17 heavy metals and harmful elements in 15 batches of Wuhaiyingliu Pills（μg/g，n＝3）

仿生提取樣品元素測(cè)定：取15批樣品，按仿生提取供試品溶液制備方法制備供試液，按擬訂條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中各元素的含量。結(jié)果Cd，Hg，Al，Se，Mo，F(xiàn)e，Sb，Sn，Ba等元素均無(wú)溶出或未檢出，其他元素均有溶出。詳見(jiàn)表5。

表5 15批五海癭瘤丸中17種重金屬及有害元素仿生提取測(cè)定結(jié)果（μg/g，n＝3）Tab.5 Determination results of 17 heavy metals and harmful elements extracted by biomimetic extraction method from 15 batches of Wuhaiyingliu Pills（μg/g，n＝3）

2.6 五海癭瘤丸重金屬風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Ⅰ：對(duì)于仿生提取檢出的元素，需要對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。參考國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）Q3D的方法［4］，PDE為每日允許暴露量，五海癭瘤丸的日最大服用劑量為18 g，按公式1）計(jì)算日最大允許暴露量，結(jié)果見(jiàn)表6。

日最大允許暴露量＝PDE/日服最大服用劑量1）

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Ⅱ：參照《中藥中外源性有害殘留物安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)指導(dǎo)原則》［5］及文獻(xiàn)［6－9］，對(duì)于五海癭瘤丸中8種仿生溶出重金屬及有害元素的暴露評(píng)估，按公式2）計(jì)算日攝入量（Exp），再按公式3）計(jì)算元素危害指數(shù)（HI）。HI值可反映中藥中重金屬及有害元素的健康風(fēng)險(xiǎn)。HI＜1表示中藥中重金屬及有害元素的健康風(fēng)險(xiǎn)較低；HI＞1表示健康風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)予以關(guān)注。

其中，A為日允許攝入量（μg/kg）；W為人體平均體質(zhì)量（一般按63 kg計(jì)）；IR為日最大劑量（18 g）；AT為平均壽命天數(shù)（365天/年×70年）；EF為中藥服用頻率（90天/年）；ED為一生的暴露年限（20年）；10為安全因子，表示每日由中藥材及其制品中攝取的重金屬量不大于日總暴露量的10%。C為樣品中元素平均濃度（mg/kg）。結(jié)果見(jiàn)表6?？梢?jiàn)，8種 元 素HI值 為0～0.168，表明五海癭瘤丸中仿生提取出的8種元素的健康風(fēng)險(xiǎn)較低。

表6 仿生溶出元素每日最大允許暴露量和最大限量理論值Tab.6 Maximum allowable daily exposure and maximum theoreticalvalue of biomimetic dissolved elements

3 討論

海洋來(lái)源藥材本身受海洋環(huán)境的影響，相較于陸生動(dòng)植物來(lái)源藥材，其重金屬及有害元素含量較高，限度值也較高，故需嚴(yán)格監(jiān)測(cè)其用藥安全性［10－15］。ICH指導(dǎo)原則Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則中1類元素As，Cd，Hg，Pb是對(duì)人體有毒性的物質(zhì)，已限制或不再用于藥品生產(chǎn)，需在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中進(jìn)行評(píng)價(jià)；2A類的元素為在藥品中出現(xiàn)可能性相對(duì)較高的元素，需對(duì)所有攝入途徑進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，如Co，Ni，V；2B類和3類是自然含量較低且在藥品中出現(xiàn)的可能性較小的元素，如Cu，Ni，Sb，Sn，Se，Li等。Al，Cr，F(xiàn)e，Ba等金屬元素易在生產(chǎn)加工過(guò)程中引入［16－17］。故選定Pb，Cd，As，Hg，Cu，Al，Co，V，Se，Mo，Cr，Ni，F(xiàn)e，Sb，Sn，Li，Ba 17種元素作為研究對(duì)象。

本試驗(yàn)中考察了人工胃液和人工腸液分別進(jìn)行提取的方式，結(jié)果樣品在人工胃液中的溶出率遠(yuǎn)高于人工腸液?？紤]到胃液為弱酸性，腸液為中性，藥物的體內(nèi)吸收過(guò)程也是先經(jīng)過(guò)胃液的提取后再接觸腸液。因此，采用人工胃液進(jìn)行仿生提取能確保仿生提取試驗(yàn)的合理性和準(zhǔn)確性［18］。

15批樣品中，As的總量均值為36 mg/kg，超過(guò)日最大允許暴露量，提示有安全隱患。仿生提取后溶出As的平均含量為2.4 mg/kg，HI為0.168。表明用藥健康風(fēng)險(xiǎn)較小。

綜上所述，五海癭瘤丸總體無(wú)重大重金屬及有害元素殘留風(fēng)險(xiǎn)，在質(zhì)量穩(wěn)定的情況下，其用藥安全可得到保障。中成藥從原料藥到成品均應(yīng)嚴(yán)格控制質(zhì)量，建議盡快建立統(tǒng)一的適應(yīng)中成藥特點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模式和質(zhì)量控制方法。