高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法測定液態(tài)乳中乳果糖含量

孫 佩，任 碩，陳柔含，古淑青*，鈕 冰，鄧曉軍

（1.上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 食品工程系，上海 200436；2.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135；3.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708）

乳果糖，又名4-Ο-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖，是液態(tài)乳熱加工過程中，乳糖在酪蛋白游離氨基的催化下堿基異構(gòu)化形成的一種雙糖［1］。乳果糖在生牛乳中含量甚微，不同的加熱處理方式產(chǎn)生的乳果糖含量不同。因此，乳果糖可作為判斷液態(tài)奶熱加工方式的重要指標(biāo)［2］。國際乳品聯(lián)合會（IDF）建議乳果糖作為區(qū)分巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳（UHT milk）的指標(biāo)，并規(guī)定其在UHT乳中的含量為100～600mg/L［3－4］。

目前乳果糖測定方法以酶催化法［5］、酶解－分光光度法［6－7］、離子色譜法［8－9］、氣相色譜法［10－11］和液相色譜法［4，7，12?13］為主。我國農(nóng)業(yè)部頒布的NY/T939－2016標(biāo)準(zhǔn)采用多步酶解反應(yīng)，紫外分光光度計檢測乳果糖［6］，但該方法需用6種酶，任何一種酶失活都將導(dǎo)致實驗失敗，且操作繁瑣耗時［7］。在離子交換色譜中，乳果糖和色譜柱離子成分之間通過進(jìn)行離子交換而保留，因此控制目標(biāo)樣品在堿性/酸性溶液中呈現(xiàn)離子化狀態(tài)是關(guān)鍵［14］。但糖類物質(zhì)在電極表面易與某些分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而影響方法的準(zhǔn)確性［15］。氣相色譜法靈敏度高，卻難以實現(xiàn)乳果糖與液態(tài)乳中其他二糖的分離［16］。Liu等［17］建立了液態(tài)乳中乳果糖的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，該方法靈敏度高，但質(zhì)譜儀器昂貴，成本較高，且需先進(jìn)行酶解以排除麥芽糖的干擾。

高效液相色譜法能同時檢測多種糖分，具有檢測效率高、靈敏度好、操作簡便等特點，其檢測器主要有示差折光檢測器（RID）和蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）［18］兩種。相對于RID，ELSD更穩(wěn)定，且分離糖類化合物效果好［19］。Schmidt等［20］開發(fā)了一種定量復(fù)雜糖溶液中乳果糖的HPLC?ELSD，能排除結(jié)構(gòu)相似或分子量相同的糖類干擾，但該方法只適用于酶法生產(chǎn)的乳果糖樣品。李盛楠等［21］使用改性酰胺柱對滅菌乳中的乳果糖進(jìn)行分離，但為避免乳中其他二糖與酰胺柱上的活性基團結(jié)合對色譜峰產(chǎn)生干擾，需在前處理過程中加入酶解步驟，增加了前處理過程的復(fù)雜度。Schuster－Wolff－Bühring等［19］發(fā)現(xiàn)氨基柱能更好地分離乳果糖、乳糖，但目前所報道的基于氨基色譜柱的乳果糖檢測均需要較長時間的梯度洗脫［18－20］。因此，雖然目前已有文獻(xiàn)報道乳果糖的HPLC－ELSD測定方法，但均存在基質(zhì)不適用，前處理復(fù)雜或檢測時間長等不同程度的問題?；诖?，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上建立了液態(tài)乳中乳果糖含量測定的HPLC－ELSD，并優(yōu)化了樣品前處理條件及儀器參數(shù)。該方法操作簡便、重復(fù)性好，可滿足液態(tài)乳中乳果糖含量的測定。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

乙腈、冰醋酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；醋酸銨（美國Sigma公司）；乳果糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，中國食品藥品檢定研究院）。

進(jìn)口液態(tài)乳樣品為法定入境檢驗檢疫樣品，國產(chǎn)液態(tài)乳樣品包括無乳糖舒化奶購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

1260InfinityⅡ液相色譜（Agilent公司，USA），配蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）；Allegra X－22R離心機（Beckman Coulter公司，美國）；高速渦旋震蕩器（Eyela公司，日本）；實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國）制得。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.1 g乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解定容至10mL，配成10mg/mL的乳果糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確吸取乳果糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液1mL至10mL容量瓶中，用85%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水溶液定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

為考察乳糖與乳果糖的分離效果，配制乳果糖含量為10mg/mL，乳糖含量為120mg/mL的乳果糖－乳糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用時用85%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水溶液稀釋至所需濃度。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品前處理 取1mL液態(tài)乳，加入1mL0.4 mol/L醋酸銨溶液（pH3.8 ），用水定容至5mL，渦旋混勻3min，以4000r/min離心5min。上清液經(jīng)0.22 μm水相膜過濾后，取100μL濾液用85%乙腈水定容至1mL，過0.22 μm有機膜，供色譜分析。

1.4.2 色譜條件色譜柱：氨基柱（Exsil100HAAX，150mm×2mm，3μm，Extreme公司，美國）；流動相：乙腈－水（85∶15，體積比），流速0.8 mL/min；洗脫時間8min；柱溫箱溫度35℃；進(jìn)樣體積10μL。

蒸發(fā)光散射檢測器條件：霧化氣溫度60℃，蒸發(fā)氣溫度70℃，載氣流速1.4 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的確定

液態(tài)奶中含有大量蛋白和脂肪，未經(jīng)前處理直接進(jìn)樣會堵塞儀器管路和色譜柱，常用的蛋白質(zhì)沉淀方法有機溶劑沉淀法和pH值調(diào)節(jié)法［13］。本實驗分別考察了95%乙醇、95%乙腈和0.4 mol/L醋酸銨（pH3.8）沉淀蛋白的效果。結(jié)果顯示：采用95%乙醇、95%乙腈沉淀蛋白后的樣品仍存在大量干擾組分（圖1A、B），無法在氨基柱上實現(xiàn)乳果糖與乳糖的分離檢測，而經(jīng)0.4 mol/L醋酸銨溶液（pH3.8 ）處理后的樣品溶液，不僅蛋白質(zhì)充分沉淀，干擾峰得以去除，乳果糖和乳糖也得以較好地分離（見圖1C）。

圖1 不同蛋白沉淀方法的色譜圖Fig.1 Chromatograms of different protein precipitation methods

2.2 ELSD條件的優(yōu)化

一般情況下，載氣流速越小，形成的顆粒半徑越大，對激光的散射能力也就越強，相應(yīng)的響應(yīng)信號越大。但流速過小會導(dǎo)致流動相不能被完全揮發(fā)，背景噪音增加，信噪比下降［22］。最優(yōu)的載氣流速應(yīng)在可接受噪音的基礎(chǔ)上產(chǎn)生最大響應(yīng)值。因此實驗在霧化氣溫度70℃，蒸發(fā)氣溫度60℃條件下，考察了不同載氣流速（1.2 、1.4 、1.6 、1.8 mL/min）對信號響應(yīng)的影響（圖2A）。結(jié)果顯示：隨著載氣流速增大，待測物的峰面積逐漸減小，但信噪比呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)載氣流速為1.4 mL/min時達(dá)到最優(yōu)。實驗選擇1.4 mL/min為最佳載氣流速。

圖2 不同載氣流速（A）、霧化氣溫度（B）和蒸發(fā)氣溫度（C）時乳果糖的色譜圖Fig.2 Chromatograms of ractulose under different gas flow rates（A），nebulous temperatures（B）and evaporative temperatures（C）

霧化氣溫度、蒸發(fā)氣溫度也是影響檢測靈敏度的重要因素。霧化氣溫度越高，待測組分霧化越充分，響應(yīng)值越高，但霧化氣溫度過高會使待測組分過度分散而導(dǎo)致響應(yīng)變低。蒸發(fā)氣溫度越高，溶劑揮發(fā)越充分，樣品顆粒經(jīng)散射后噪聲降低，響應(yīng)值越高，但蒸發(fā)氣溫度過高會導(dǎo)致待測組分分解而響應(yīng)降低。因此，固定載氣流速不變，分別考察了霧化器溫度、蒸發(fā)氣溫度對檢測信號的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，霧化氣溫度為70℃，蒸發(fā)氣溫度為60℃時，乳果糖的響應(yīng)最高（圖2B、C）。

2.3 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

按“1.3 ”方法配制質(zhì)量濃度分別1.0 、2.0 、5.0 、10、20、50、100mg/L的乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下，以乳果糖質(zhì)量濃度的對數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)峰面積的對數(shù)值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0 ～100mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=1.299 x+0.1176 ，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9980 。

以無乳糖舒化奶為空白基質(zhì)，通過基質(zhì)加標(biāo)確定方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10），該方法LOD為15mg/L，LOQ為50mg/L。

2.4 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在優(yōu)化條件下，分別考察了乳果糖在巴氏滅菌乳以及超高溫滅菌乳中的回收率。采用質(zhì)譜法［17］測得巴氏殺菌乳中乳果糖的本底平均值為4.6 mg/L，超高溫滅菌乳中乳果糖的本底平均值為383mg/L；根據(jù)不同基質(zhì)中乳果糖的本底含量差異，設(shè)置巴氏滅菌乳中3個加標(biāo)水平分別為50、100、500mg/L，超高溫滅菌乳中3個水平分別為200、400、800mg/L，每個水平平行測定6次，得乳果糖在巴氏滅菌乳以及超高溫滅菌乳中的回收率為85.1%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不高于7.5 %（表1）。

表1 乳果糖的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table1 Spike recoveries and RSDs of lactulose（n=6）

2.5 實際樣品的檢測

采用本方法檢測20個國內(nèi)外超高溫瞬時滅菌乳中的乳果糖含量。結(jié)果顯示：超高溫瞬時滅菌乳的乳果糖含量為350～751mg/L（表2），不同樣本間乳果糖含量差異較大。根據(jù)國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T939－2016規(guī)定（超高溫瞬時滅菌乳中乳果糖含量不應(yīng)超過600mg/L），大部分市售超高溫瞬時滅菌乳均在限定范圍內(nèi)，僅1個樣品超出規(guī)定范圍，表明存在液態(tài)奶循環(huán)處理或熱處理過程中溫度過高的可能，典型樣品的乳果糖色譜圖見圖3。

表2 實際樣品中乳果糖的測定結(jié)果Table2 Determination result of lactulose in real samples

3 結(jié) 論

液態(tài)乳中的乳糖含量遠(yuǎn)高于乳果糖，普通方法難以將二者分離，增加了乳果糖定量的難度。本研究采用醋酸銨沉降蛋白，氨基柱分離，建立了HPLC－ELSD測定液態(tài)乳中乳果糖含量的分析方法。方法前處理快速簡便，色譜柱適用性強，穩(wěn)定性好，在優(yōu)化條件下，該方法可長時間內(nèi)保持良好的分離效果和較高的靈敏度。整個液相檢測僅需8min，與現(xiàn)有方法約需30min相比，檢測效率大大提高，可用作液態(tài)乳中乳果糖的日常檢測。