畜禽肉及飼料中氟苯尼考殘留免疫分析方法研究

謝美嬋，楊金易，李 然，肖治理，王 弘，徐振林，孫遠明，沈玉棟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院/廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F，圖1）是新一代氯霉素類廣譜抗菌藥［1］，具有抗菌廣譜、吸收好、體內(nèi)分布廣、安全高效等特點。自氯霉素禁用后，氟苯尼考作為氯霉素的替代物，常用于畜禽呼吸道和消化道細菌性感染病的防治［2］。但氟苯尼考具有血液毒性和胚胎毒性等，且隨著使用范圍和劑量加大，細菌也會對其產(chǎn)生耐藥性［3－4］。我國2019年發(fā)布的GB31650－2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定氟苯尼考在不同動物組織中的殘留限量為0.1 ～30.0 μg/g［5］。然而，隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，氟苯尼考濫用導(dǎo)致其在畜禽體內(nèi)積累，引發(fā)的畜禽食品安全問題日益突出［6］，對人們的健康產(chǎn)生了巨大潛在危害。因此，開發(fā)靈敏準(zhǔn)確的檢測方法對畜禽產(chǎn)品中的氟苯尼考殘留進行監(jiān)管至關(guān)重要。

圖1 氟苯尼考化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of florfenicol

目前，針對氟苯尼考殘留的檢測方法主要是儀器方法［7－9］，這些方法靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是前處理要求高、操作專業(yè)性強，不能實現(xiàn)高通量現(xiàn)場篩查。免疫分析方法［10］具有低成本、高通量的優(yōu)點，與大型儀器確證方法優(yōu)勢互補，顯著提高了畜禽產(chǎn)品及飼料獸藥殘留的檢測效率。近年來，食品中氟苯尼考殘留的免疫分析方法有一定發(fā)展，但這些方法多數(shù)與同類的氯霉素有顯著交叉反應(yīng)［11－13］。而氯霉素為禁用獸藥，氟苯尼考是限量獸藥，兩者的檢測要求懸殊，其顯著的交叉反應(yīng)導(dǎo)致無法判別測定結(jié)果。孫法良等［14］建立的雞肉中氟苯尼考殘留檢測的酶聯(lián)免疫吸附分析方法與氯霉素等無顯著交叉反應(yīng)，但半抑制濃度（IC50）僅79.3 ng/mL，靈敏度并不十分理想。

本研究擬在前期基礎(chǔ)上［15］篩選制備針對氟苯尼考的高特異性單克隆抗體，并建立靈敏準(zhǔn)確的免疫分析方法，以期為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；氮吹儀（康寧科技有限公司）；QP50質(zhì)譜儀（日本島津公司）；DRX－600NMR核磁共振儀（德國瑞士Bruker公司）；UV－3010紫外可見分光光度計（日本Hitachi公司）。

氟苯尼考、氯霉素、恩諾沙星等標(biāo)準(zhǔn)品（上海麥克林生化科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、碳二亞胺（EDC）、Freund完全佐劑與不完全佐劑、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（美國Sigma公司）；N，N-二甲基甲酰胺（上海阿拉丁試劑公司）；T液為0.05 mol/L Tris－HCl緩沖液（pH8.0 ）；P液為0.025 mol/L磷酸緩沖液（pH7.5 ）；PBS為0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4 ）；PBST為0.01 mol/L含0.05 %吐溫－20的磷酸緩沖液（pH7.4 ）；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。半抗原FFD為本實驗室自制［15］（圖2）；小鼠骨髓瘤SP2/0（本實驗室保存）；SPF級BALB/c雌性小鼠購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心（廣東佛山）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工抗原的制備與鑒定采用活潑酯法［16］將半抗原FFD（圖2）分別與載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)制備免疫原FFD－BSA和包被原FFD－OVA，并采用紫外掃描法和三硝基苯磺酸法（TNBS）對抗原進行鑒定和偶聯(lián)比測算［17］。

圖2 抗原合成路線圖Fig.2 Synthetic routes of antigens FFD－BSA and FFD－OVA

1.2.2 單克隆抗體的制備與評價參照文獻［18］，使用免疫原FFD－BSA平行免疫3只6～8周齡的雌性Balb/c小鼠，3免后對小鼠進行尾靜脈取血，通過間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法（icELISA）對抗血清性能進行評價，選用免疫應(yīng)答最好的小鼠的脾臟與SP2/0進行融合［19－20］，將篩選到的細胞株進行體外培養(yǎng)和腹水制備，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法［21］分離純化后保存至－20℃冰箱備用。采用酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）對抗體效價和抑制率進行測定評價。

1.2.3 icELISA方法的建立 參考文獻［18］，采用棋盤法選擇A450nm在1.0 ～1.5 之間的包被原質(zhì)量濃度（0.125 、0.083 、0.0625 、0.05 μg/mL）和抗體質(zhì)量濃度（0.167 、0.125 、0.1 、0.083 μg/mL）組合進行抑制曲線繪制，并根據(jù)IC50確定最佳包被原質(zhì)量濃度與抗體質(zhì)量濃度；然后，采用單因素實驗優(yōu)化藥物和抗體稀釋液（PBST、T液、P液、PBS）、抗體稀釋液吐溫－20含量（0.05 %、0.1 %、0.2 %、0.5 %）、一抗競爭反應(yīng)時間（20、30、40、50min）、酶標(biāo)二抗稀釋液（P液、T液、PBST、PBS）、初始質(zhì)量濃度為1μg/mL的酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)（4000、5000、6000、7000倍）、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間（20、30、40、50min）等影響因素。最佳反應(yīng)條件應(yīng)具備適當(dāng)?shù)奈庵担ˋmax）、較低的IC50和較高的Amax/IC50比值。Amax/IC50越高，IC50越低，即靈敏度越高，綜合最佳反應(yīng)條件建立氟苯尼考的icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，縱坐標(biāo)B、B0分別表示添加和未添加氟苯尼考時的吸光度，橫坐標(biāo)為靶標(biāo)藥物質(zhì)量濃度。

1.2.4 抗體的特異性以抗體對標(biāo)準(zhǔn)品靶標(biāo)藥物的IC50值為參照，采用以下公式測算結(jié)構(gòu)及功能類似物的交叉反應(yīng)率（CR）：

CR（%）=［IC50（FF）/IC50（FF類似物）］×100%

1.2.5 穩(wěn)定性試驗精密度與穩(wěn)定性是評價免疫檢測試劑盒可靠性與應(yīng)用性的重要參數(shù)。取不同時間包被的酶標(biāo)板在同一時間進行icELISA實驗，考察方法的精密度；同時將試劑盒置于37℃進行保存時間測試實驗，在第0、2、4、6d各測定一次并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察方法的穩(wěn)定性。分別計算不同批次板和不同存放時間的IC50、Amax、IC20～IC80。

1.2.6 前處理及加標(biāo)回收實驗肉組織樣品：稱取3g打碎后的空白肉樣于15mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯和適量NaCl沉淀蛋白，振蕩混勻5min后4000r/min離心5min，共提取2次。合并的上清液經(jīng)氮氣吹干后加入3mL PBS及3mL正己烷，混勻后4000r/min離心5min，PBS層備用。

飼料樣品：稱取空白動物飼料1g于15mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯，混勻后于4℃下4000r/min離心10min，共提取2次。合并上清液經(jīng)氮氣吹干后加入1mL正己烷和1mL PBS，振蕩混勻后4000r/min離心10min，PBS層備用。

根據(jù)所建立icELISA方法的靈敏度與樣品處理情況，將上述制備的空白樣品分別添加高、中、低3種濃度水平的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，按照3孔平行，以icELISA進行測定，計算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.7 儀器確證方法比對采用中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T1865－2016）［22］和農(nóng)業(yè)部2483號公告－8－2016的HPLC－MS/MS方法［23］，對樣品中的氟苯尼考進行檢測，并與icELISA方法結(jié)果進行確證比對。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工抗原制備與鑒定

載體蛋白和半抗原在紫外掃描下會表現(xiàn)出各自不同的特征吸收峰，半抗原成功偶聯(lián)載體蛋白后，分子間通過共價鍵產(chǎn)生共軛與電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致峰形或峰位發(fā)生一定變化，基于此可判斷人工抗原是否偶聯(lián)成功［16］。UV－Vis圖譜顯示（圖3），免疫原FFD－BSA的特征吸收峰變寬，且從BSA的280nm紅移至287nm；包被原FFD－OVA的特征吸收峰也變寬，并從OVA的280nm紅移至286nm，峰形及峰位與半抗原、載體蛋白區(qū)別明顯。說明免疫原和包被原均合成成功。另外，用TNBS法測得標(biāo)準(zhǔn)載體蛋白BSA和OVA氨基消耗數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.1181 x（r2=0.9981 ）和y=0.0516 x（r2=0.9913 ），經(jīng)測算得到人工抗原FFD－BSA和FFD－OVA的偶聯(lián)比分別為12∶1和17∶1。

圖3 半抗原、載體蛋白及人工抗原的紫外光譜Fig.3 Ultraviolet spectra of haptens，carrier protein and synthesized antigens

2.2 抗血清評價與單克隆抗體制備

第3次免疫后，檢測鼠抗血清效價和抑制率［17］。結(jié)果顯示，在1μg/mL包被原和1μg/mL氟苯尼考藥物濃度下，3只平行實驗小鼠抗血清的效價/抑制率分別為128k/74%、64k/75%和128k/70%。效價和抑制率越高，說明該抗血清的親和力和識別氟苯尼考的靈敏度越好。因此，選取效價/抑制率為128k/74%的小鼠進行細胞融合。通過ELISA篩選，獲得了細胞上清效價/抑制率為128k/92%的細胞株，并進一步通過細胞體外培養(yǎng)、腹水制備、純化得到氟苯尼考單克隆抗體，用于后續(xù)實驗。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以Amax/IC50、IC50和Amax值作為考察依據(jù)［17］，確定最佳工作條件為：包被抗原質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL，抗體質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL（稀釋10000倍），最佳藥物、抗體和二抗稀釋液均為PBST，抗體稀釋液的最佳吐溫－20含量為0.05 %，競爭反應(yīng)時間為30min，二抗質(zhì)量濃度為0.167 μg/mL（稀釋6000倍），二抗反應(yīng)時間為30min。在該最佳條件下，建立氟苯尼考的icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），其對氟苯尼考的IC50為9.48 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～IC80）為1.75 ～51.36 ng/mL，檢 出 限（IC10，LOD）為0.64 ng/mL。

圖4 氟苯尼考的icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）Fig.4 Dose?response curve for florfenicol in icELISA（n=3）

2.4 特異性分析

測定抗體對類似物的交叉反應(yīng)率（CR）可以評價抗體的特異性，CR越小說明抗體對靶標(biāo)藥物的特異性越高。實驗結(jié)果表明，以氟苯尼考為參照，所建立的icELISA方法與氟苯尼考的CR為100%，與其它結(jié)構(gòu)功能類似物氯霉素、氟苯尼考胺、恩諾沙星、西諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、呋喃他酮、呋喃西林、四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶基本不存在交叉反應(yīng)，說明所建立的icELISA方法對氟苯尼考具有良好特異性。

2.5 精密度與穩(wěn)定性

按照“1.2.5 ”考察icELISA方法的精密度和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，批次間IC50的平均值為5.19 ng/mL，Amax平均值為1.13 ，RSD＜7.5 %；不同存放天數(shù)間的IC50平均值為5.25 ng/mL，Amax平均值為1.36 ，RSD＜7.5 %。上述實驗結(jié)果說明所建立的方法精密度和穩(wěn)定性良好。

2.6 基質(zhì)干擾效應(yīng)消除

樣品經(jīng)“1.2.6 ”前處理后用PBST稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以氟苯尼考做標(biāo)準(zhǔn)品進行icELISA測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察基質(zhì)效應(yīng)消除情況。結(jié)果表明：豬肉、雞飼料和豬飼料基質(zhì)用PBST稀釋5倍，牛肉、雞肉基質(zhì)用PBST稀釋10倍后，基質(zhì)條件下抑制曲線與氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線均能基本重合，樣品基質(zhì)效應(yīng)基本消除。

2.7 加標(biāo)回收實驗

選擇豬肉、雞肉、牛肉、雞飼料和豬飼料5種陰性空白樣品，添加高、中、低3個濃度水平，按“1.2.6”處理后將提取液稀釋相應(yīng)倍數(shù)，用icELISA方法和HPLC－MS/MS法分別檢測其回收率。結(jié)果表明（表1）：icELISA方法的加標(biāo)回收率為88.1 %～107%，RSD＜15%，與HPLC－MS/MS結(jié)果一致。說明建立的icELISA方法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1 氟苯尼考樣品的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table1 Recoveries and RSDs of florfenicol in blank samples（n=3）

2.8 盲樣檢測

在當(dāng)?shù)爻屑笆袌鲭S機購買豬肉、雞肉、牛肉、雞飼料和豬飼料共15份樣品，前處理后進行檢測，其中4份檢出氟苯尼考殘留，但均低于50μg/kg，小于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最低限量值100μg/kg［5］，因此均可判定為陰性。該結(jié)果與HPLC－MS/MS的測判結(jié)果一致，說明建立的icELISA方法可用于真實樣品中氟苯尼考殘留量的測定。

3 結(jié) 論

本研究基于特異性單克隆抗體，建立了畜禽肉及與飼料樣品中氟苯尼考殘留的icELISA檢測方法，其檢出限達0.64 ng/mL，且與其它結(jié)構(gòu)功能類似物無明顯交叉，特異性良好。樣品的加標(biāo)回收率為88.1 %～107%，與HPLC－MS/MS法檢測結(jié)果一致，適用于動物源性食品及飼料中氟苯尼考的快速檢測。