KRAS、BRAF基因突變的結(jié)直腸癌患者臨床病理特征分析

劉威，王菲，杜洪，繆娜波，李旺林,，曹杰,

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院，廣州消化疾病中心，結(jié)直腸肛門(mén)外科,廣東 廣州 510180; 2.廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院，華南理工大學(xué)消化疾病研究所,廣東 廣州 510180; 3.廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510180)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，最新研究表明，CRC在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第3位和第2位[1]。在中國(guó)，CRC的發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升趨勢(shì)[2-4]，預(yù)測(cè)在2025年，中國(guó)CRC發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)將分別達(dá)到64.23萬(wàn)例和22.11萬(wàn)例[5]。因其發(fā)病隱匿，多數(shù)確診都屬于中晚期，而晚期CRC患者5年生存率只有14%[6]。除了手術(shù)治療、化療、放療等常規(guī)治療外，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)的分子靶向藥物西妥昔單抗、帕尼單抗等在晚期CRC患者中也得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[7-13]。研究表明抗EGFR靶向治療效果與KRAS和BRAF基因突變密切相關(guān)，KRAS和BRAF基因野生型患者在抗EGFR靶向治療中獲益更多[9-20]。

目前，相關(guān)研究主要集中在KRAS和BRAF基因的突變頻率及其預(yù)后價(jià)值上，但對(duì)于這些基因突變與患者臨床病理特征的關(guān)系仍缺乏了解，本研究回顧性分析了2017年7月至2020年12月我院收治的724例CRC患者的KRAS基因和BRAF基因突變情況，以及KRAS基因和BRAF基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性，為CRC的個(gè)體化分子靶向治療提供理論指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集廣州市第一人民醫(yī)院2017年7月至2020年12月期間收治的724例CRC患者的臨床病理資料，年齡19～94歲，平均年齡(64.55±12.39)歲，所有患者均進(jìn)行KRAS及BRAF基因突變的檢測(cè)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得患者本人或其家屬的知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理確診為CRC；(2)行外科手術(shù)切除；(3)接受KRAS及BRAF基因突變檢測(cè)；(4)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他類(lèi)型惡性腫瘤。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1組織DNA的提取 選取1～3張5 μm厚的石蠟包埋的CRC組織切片，按照FFPE樣品DNA分離試劑盒說(shuō)明書(shū)(離心柱型)(廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)提取基因組DNA。

1.3.2基因突變檢測(cè) 按照人類(lèi)KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒、人類(lèi)BRAF基因V600E突變檢測(cè)試劑盒(廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)，運(yùn)用突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)PCR檢測(cè)KRAS基因第2、3、4號(hào)外顯子突變及BRAF基因第15號(hào)外顯子第600位密碼子突變。

1.3.3免疫組化 本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)了MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、Ki-67、P53、CD34、D2-40、S-100在蛋白水平的表達(dá)情況，使用的抗體信息如下：MLH1兔單抗、PMS2兔單抗、MSH2兔單抗、MSH6兔單抗、Ki-67兔單抗、CD34兔單抗、D2-40兔單抗、S-100兔單抗(廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司)、P53鼠單抗(上海羅氏制藥有限公司)。CD34、D2-40用于了解脈管浸潤(rùn)情況，S-100用于了解神經(jīng)浸潤(rùn)情況。

其中MLH1、PMS2、MSH2、MSH6為錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)蛋白，觀察染色強(qiáng)度，根據(jù)有無(wú)著色分為陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)，至少1種錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)陰性為錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)，4種錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)陽(yáng)性為錯(cuò)配修復(fù)功能完整(proficient mismatch repair，pMMR)。計(jì)數(shù)著色細(xì)胞所占百分比：每張切片先低倍鏡觀察全片，然后隨機(jī)選取10個(gè)視野，在高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例，Ki-67按照陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比例分為4組：0(0%～5%)，1(6%～25%)，2(26%～50%)，3(>50%)。P53、脈管、神經(jīng)浸潤(rùn)觀察染色強(qiáng)度，根據(jù)有無(wú)著色分為陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)。

1.4 臨床病理特征

收集患者的性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、TNM分期、大體類(lèi)型、分化程度、組織學(xué)分型等臨床病理特征，根據(jù)KRAS和BRAF基因突變情況，將CRC患者分為野生型(wild type，WT)、KRAS突變型(KRAS mutation，KRAS MT)和BRAF突變型(BRAF mutation，BRAF MT)3組，其中不包含KRAS和BRAF雙突變類(lèi)型。3組患者的臨床病理特征進(jìn)行兩兩比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；計(jì)數(shù)資料以絕對(duì)數(shù)和百分比[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。并非全部患者進(jìn)行免疫組化指標(biāo)檢測(cè)，未進(jìn)行免疫組化檢測(cè)的患者計(jì)入未知病例，不納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 724例CRC患者整體特征

CRC患者整體臨床病理特征及免疫組化信息見(jiàn)表1。

表1 CRC患者整體特征(724例)

2.2 KRAS和BRAF基因突變類(lèi)型情況

724例CRC患者中，KRAS基因總突變率為30.4%(220/724)，第2號(hào)外顯子突變率最高，為27.6%(200/724)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BRAF基因第15號(hào)外顯子V600E位點(diǎn)突變率為4.0%(29/724)。2種基因外顯子突變情況見(jiàn)表2。

表2 KRAS和BRAF基因不同外顯子突變比例

2.3 KRAS和BRAF基因突變類(lèi)型與臨床病理特征的關(guān)系

本研究回顧性分析了不同基因突變類(lèi)型CRC的臨床病理特征，將WT組、KRAS MT組、BRAF MT組兩兩進(jìn)行比較。與WT組相比，KRAS突變的CRC多發(fā)生于男性，浸潤(rùn)型比例更高(P<0.05)；與WT組相比，BRAF突變的CRC多發(fā)生于女性、右半結(jié)腸，dMMR、浸潤(rùn)型、低分化或黏液腺癌比例更高(P<0.05)。與KRAS突變的CRC相比，BRAF突變的CRC多發(fā)生于右半結(jié)腸，dMMR、低分化或黏液腺癌比例更高(P<0.05)(表3)。

表3 野生型與KRAS、BRAF基因突變的CRC臨床病理特征的對(duì)比

3 討 論

CRC的發(fā)生發(fā)展受多因素、多基因和多個(gè)信號(hào)通路的影響，其中EGFR信號(hào)通路與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，二聚體化后通過(guò)激活RAS蛋白，從而激活下游的RAS/RAF/MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)信號(hào)通路的傳導(dǎo)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化等多種生物學(xué)功能[21]。RAS基因最早于1982年在鼠肉瘤病毒中被發(fā)現(xiàn)，因此被命名為RAS(rat sarcoma)基因[22]，KRAS基因定位于人類(lèi)染色體12p，與HRAS基因、NRAS基因同屬于RAS基因家族。BRAF基因定位于人類(lèi)染色體7q，編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與ARAF、CRAF同屬于RAF基因家族。KRAS基因和BRAF基因作為EGFR信號(hào)通路下游關(guān)鍵分子，與抗EGFR治療耐藥性密切相關(guān)。CRC患者治療前行常規(guī)KRAS和BRAF基因突變檢測(cè)，這對(duì)于EGFR靶向藥物的使用和患者預(yù)后非常重要[7-15]。

研究表明，與野生型CRC相比，KRAS和BRAF突變的CRC有特異性的臨床、病理和分子特征，突變基因與腫瘤惡性程度有關(guān)[18,26]。KRAS基因和BRAF基因雖同屬一條信號(hào)通路，但KRAS突變和BRAF突變同時(shí)發(fā)生的比例較低，且兩種突變類(lèi)型的CRC常表現(xiàn)出不同的臨床病理特征[23,27]。例如，KRAS突變的CRC具有更強(qiáng)的侵襲性，多發(fā)生于左半結(jié)腸，容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，與MSS/pMMR狀態(tài)相關(guān)[21,27-29]。而B(niǎo)RAF突變的CRC多發(fā)生于老年女性、右半結(jié)腸，預(yù)后也很差，且更容易發(fā)生肝、腹膜及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[16,22,25]；在病理特征方面表現(xiàn)為分化差、黏液腺癌成分增多和高侵襲性，與MSI-H/dMMR狀態(tài)相關(guān)。BRAF突變是鋸齒狀通路的驅(qū)動(dòng)因素，鋸齒狀息肉也被認(rèn)為是CRC的前驅(qū)病變，而鋸齒狀息肉最常見(jiàn)于MSI-H/dMMR的CRC，這很好地解釋了BRAF突變和MSI-H/dMMR的關(guān)系[26,27]。

本研究通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，BRAF突變的CRC多發(fā)生于右半結(jié)腸，dMMR、低分化或黏液腺癌比例更高，KRAS突變的CRC多發(fā)生于左半結(jié)腸，pMMR、高、中分化腺癌比例更高，提示與野生型和KRAS基因突變的CRC相比，BRAF突變的CRC可能預(yù)后更差，這些都與相關(guān)報(bào)道一致[23,24,27]。

總之，本研究通過(guò)在較大樣本的CRC患者中分析KRAS和BRAF基因突變類(lèi)型狀態(tài)，對(duì)比KRAS和BRAF兩種突變類(lèi)型的CRC臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)與KRAS突變的CRC相比，BRAF突變的CRC多發(fā)生于右半結(jié)腸，dMMR、低分化或黏液腺癌比例更高，惡性程度更高?？赡芴崾緝煞N基因在CRC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中存在的差異性特征，臨床需要對(duì)這兩種基因進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，才能更好地指導(dǎo)CRC的個(gè)體化靶向治療。但是KRAS和BRAF突變?cè)贑RC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制以及抗EGFR的治療效果和預(yù)后情況還有待進(jìn)一步研究。